蛋白质研究技术.ppt

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1、蛋白质研究技术一、蛋白质的理化性质蛋白质的胶体性质蛋白质的两性电离蛋白质分子颗粒大小1100nm之间,属胶体颗粒范围蛋白质的胶体原因：表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力蛋白质的胶体性质在溶液中能形成稳定的胶体当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀(一)蛋白质的沉淀概念:应用应用:(1)蛋白质分离纯化 (2)解毒(3)临床检验 蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀蛋白质胶体性质与蛋白质沉淀1 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）；、高浓度中性盐（盐析、盐溶）；2 2、酸碱（等电点沉淀）；、酸碱（等电点沉淀）；3 3、有机

2、溶剂沉淀；、有机溶剂沉淀；4 4、重金属盐类沉淀；、重金属盐类沉淀；5 5、生物碱试剂沉淀、生物碱试剂沉淀6 6、加热变性沉淀、加热变性沉淀(1)盐析法(saltingout)常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法概念：向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性 作用原理:盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的 水化层，减少分子间静电斥力(2)有机溶剂沉淀法 注意事项:必须在低温下操作 尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去缺点：常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性 原理:使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电 常数使蛋白

3、质表面电荷减少，导致蛋白质分 子聚集而沉淀常用有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮(3)重金属盐沉淀法若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：缺点：此法常使蛋白质变性失活此法常使蛋白质变性失活原理:重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法缺点：缺点：常引起蛋白质变性原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀注意事项:反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在等电点沉淀：等电点沉淀：pH=

4、pI时引起蛋白质的沉淀(二)蛋白质的凝固概念：概念：变性蛋白质互相凝聚或互相穿插在一起的现象称蛋白质的凝固，凝固作用本质上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果如加热可使蛋白质变为不能再溶解的凝块如加热可使蛋白质变为不能再溶解的凝块超滤：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通 过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在 膜上，称为超过滤透析：将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化（三）透析和超滤透析工作图半透膜原理半透膜原理磁力搅拌器磁力搅拌器透析袋透析袋超滤工作图(四)电 泳概念：带电颗粒在

5、电场中向着所带电荷相反方向移动的现象原理：不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的 不同而有不同的泳动速度，从而达到分析 和分离蛋白质的目的应用：电泳技术是生化常用分析技术之一(四)电 泳分类：自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳蛋白质溶于缓冲液中进行电泳区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进 行电泳，不同组分形成带状区域行电泳，不同组分形成带状区域 -纸电泳：纸电泳：用滤纸作为支持物用滤纸作为支持物 -凝胶电泳：凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物支持物圆盘电泳：圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电

6、泳玻璃管中进行的凝胶电泳平板电泳：平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳在铺有凝胶的玻板上进行的电泳+圆盘电泳圆盘电泳平板电泳平板电泳(四)电 泳电泳的应用：蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE,Native-PAGE蛋白质等电点的测定：IsoelectricFocusing蛋白质组学研究：双向电泳样品处理样品处理染色染色电泳电泳蛋白质分子量的测定（SDS-PAGE）(四)电 泳(四)电 泳蛋白质等电点的测定等电聚焦等电聚焦第二相电泳第二相电泳染色染色 主要用于蛋白质组学研究蛋白质双向电泳(2D-PAGE)(四)电 泳(五)层 析原理：溶质在互不相溶的两相之间分配行为存在差 别，从而导致移动速

7、度的不同 离子交换色谱(ionexchangechromatography)疏水作用色谱(hydrophobicchromatography)凝胶过滤色谱(gelfiltrationchromatography)亲和色谱(affinitychromatography)金属螯和色谱(metalchelatingchromatography)离子交换色谱原理：根据离子交换树脂对各种离子的亲和力不同 而达到分离的目的，大分子因与树脂亲和力 不同，以不同牢度被吸附于离子交换剂，通 过改变离子强度或(和)pH使大分子从树脂上 先后被洗脱 分为：阴离子交换基：DEAE（二乙胺乙基）QAE（季铵乙基）阳离子

8、交换基：CM（羧甲基）P（磷酸基）SP（磺丙基）实验条件的选择2468101214等等电电点点-体系体系pH蛋白质带负电荷蛋白质带负电荷+蛋白质带正电荷蛋白质带正电荷 根据蛋白的性质选择适宜的pH值和缓冲体系0实验条件的选择P P+P P0 0P P-P P2-2-P P3-3-P P3-3-P P2-2-P P-P P+P P0 0P P3-3-P P2-2-P P-P P+P P0 0 根据蛋白的性质选择合适的洗脱条件疏水作用色谱原理：根据蛋白质与吸附剂之间的弱疏水性 作用的差别进行蛋白质的分步洗脱各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂常用的疏水性配基：苯基、短链烷基C3C

9、8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚疏水吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，过小则疏水性吸附作用不足，过大则洗脱困难 疏水作用色谱的洗脱一般采用降低缓冲液中的盐浓度来 洗脱蛋白也可以采用加入少量的有机溶剂来洗脱，如反相色谱疏水作用色谱Fraction凝胶过滤色谱概念：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据 它们分子大小不同而进行分离的技术，又可称作排 阻色谱或者分子筛色谱原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物 流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶 孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被 洗脱出来；比网孔小的分子能不

10、同程度的自由出入 凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较 慢，最后被洗脱出来常用凝胶：交联葡聚糖凝胶（Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶（Sepharose）凝胶过滤色谱的洗脱凝胶过滤色谱的应用生物大分子的分离纯化分子量的测定分级分离溶液浓缩平衡常数的测定细胞及颗粒的分离亲和色谱原理：利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异 结合的化合物（称配体）连接到固相载体 上，当待提纯的生物大分子通过此层析柱 时，可以与载体上的配体特异的结合而留在 柱上，其他物质则不能结合，然后用适当方 法使生物大分子从配体上洗脱下来，从而达 到分离提纯的目的 特点：纯化效率高，提纯度可达几千倍配体配体蛋

11、白质蛋白质蛋白质和配体复蛋白质和配体复合物合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配游离配体体洗脱结合耦联作用机理亲和色谱的洗脱亲和色谱的应用 抗原和抗体 激素和受体蛋白 凝集素和多糖(糖蛋白)酶与辅酶(或产物、抑制剂)核酸与互补链（或核酸多聚酶、结合蛋白）细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）金属螯合色谱原理：利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配 基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固 定相上，二价金属离子可以与流动相中含有 的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生 特异螯合作用而进行分离NH2NH2NiHisHisHisHisprotein特点：

12、体系复杂:含量低、组分多、干扰大水溶液体系：接近生理状态，尽量避免 使用有机溶剂低温操作：防止蛋白变性和失活必要的添加剂：蛋白酶抑制剂、还原剂专业的仪器设备：制备型 蛋白质分离、纯化和鉴定蛋白质分离、纯化和鉴定蛋白质分离提纯的原则：纯度、活性和产量蛋白质分离提纯的一般步骤：破碎细胞 蛋白提取 粗细分级 鉴定分离纯化技术 综合运用各种方法和技术蛋白质分离纯化方法按蛋白质性质分类 溶解度：沉淀(盐析、有机溶剂、等电点)分子大小、形状：离心、超滤、透析、凝胶过滤层析 分子大小、电荷：电泳、离子交换层析 分子间作用力：亲和层析、金属鳌合层析、疏水作用层析蛋白质分离纯化方法按纯化方法分类 沉淀：盐析、有

13、机溶剂、等电点 电泳：凝胶电泳、等电聚焦 离心：常规、密度梯度 过滤：超滤、透析 层析：离子交换、凝胶过滤、亲和层析、疏水作用蛋白分离纯化的目的活力的生化分析蛋白的翻译后修饰（Post-translationalmodifications)相互作用和蛋白的装配(Interactionsandassembly)三维结构(3-dimensionalstructure)生物功能分析(Analysisofbiologicalfunction)药物开发(Drugdevelopment)从有机体中获得纯的蛋白要尽可能的用较少 的步骤，尽可能少的丢失活力分离纯化策略分离纯化策略 细胞与组织(材料来源有限，但

14、是蛋白是天然的状态)折叠均一,可溶（主要指非膜蛋白）可通过差速离心分离细胞组份 纯化可用色谱方法（chromatography）从哪儿开始？cDNA克隆（为目前蛋白来源的主要方法，但是蛋白易形成包涵体（inclusionbody）重组蛋白基因在大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞中表达 也用差速离心及色谱方法纯化 在重组的蛋白中可以添加Tags以便于纯化从哪儿开始？破碎细胞破碎细胞上上清清沉淀沉淀(丢弃丢弃)离心离心细胞裂解细胞裂解细胞裂解物细胞裂解物,蛋白蛋白 核酸及小分子核酸及小分子多步纯化多步纯化(包括盐析包括盐析、过滤过滤、层析等层析等)不需要的分子不需要的分子 纯蛋白纯蛋白从组

15、织细胞中进行蛋白分离流程图蛋白质粗分离 I I：从组织细胞-提 取 哪个物种合适？丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况 哪个组织合适?对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关 非常有益的信息 大小、组成影响组织提取的因素缓冲液（Buffer）离子强度（Inoicstrength）金属离子螯合剂（Metalionchelators）还原剂（Reducingagents）蛋白酶抑制剂（Proteaseinhibitors）温度（Temperature）组织的破碎方式（Tissuedisruption）组织破碎(Tissuedisrupti

16、on)除去不要的组织搅碎匀浆（homogenization）研磨(vesselforextraction)细胞破碎(CellDisruption)化学破碎:碱、有机溶剂、去污剂 酶学手段:溶菌酶、葡聚糖酶、几丁质酶 (常适用于含细胞壁的细菌及植物细胞)物理方法:渗透压震荡、冻溶 机械方法:超声、匀浆、湿磨、压力初步纯化-热变性 不同的蛋白有 不同的热稳定 性，且有些蛋 白可以在热变 性以后再复性 钙调蛋白是能 通过热变性而 获得纯化的一 个很好例子天天然然结结构构(%)一般蛋白一般蛋白0()100钙调蛋白钙调蛋白初步纯化-沉淀盐析：减少蛋白质表面的水化层 硫酸铵、尿素等电点沉淀：降低蛋白质分子

17、的荷电状态 改变体系pH值至pI附近有机溶剂沉淀：减少蛋白表面水化层，增加疏水性 降低水的介电常数，降低蛋白溶解性 甲醇、乙醇、丙酮、聚乙二醇蛋白质粗分离 II：表达蛋白 重组基因的表达 可获得大量的蛋白 可进行突变-structure/activitystudies 可引入具有光谱特性的物质 可引入稳定同位素15N、2H、13C(forNMR)蛋白融合体便于纯化及免疫学研究菌体菌体细胞破碎细胞破碎总蛋白总蛋白纯蛋白纯蛋白性质分析性质分析培养介质培养介质细胞碎片细胞碎片非目的蛋白非目的蛋白离心、过滤物理、化学、酶学方法多步纯化步骤重组蛋白分离纯化蛋白质的精细纯化 基本策略：综合运用各种层析技术

18、，尤其是特异性比较高的方法，如亲和层析，可以大大减少纯化的步骤和工作量，提高产品的纯度蛋白质的鉴定定性分析：分子量:凝胶电泳、质谱 (可同时鉴定分子量和纯度)活性:根据蛋白质的功能选用不同的活 性检测方法SDS-PAGE测定蛋白质的分子量和纯度 MALDI-TOF-MS测定蛋白质的分子量和纯度 蛋白质的鉴定定量分析：Folin-酚试剂法（Lowry法）：A500nm灵敏度高、是常用的方法考马斯亮蓝染色法（Bradford法）：A595nm简单迅速、干扰少、灵敏度高(1g)紫外检测法：浓度(mg/mL)=1.45A280nm-0.74A260nm简单快速、不破坏样品、准确度低常用仪器FPLCFPLC层析冷柜层析冷柜层析冷柜层析冷柜超声波破碎超声波破碎超声波破碎超声波破碎蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳蛋白电泳冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥冷冻干燥高速冷冻离心高速冷冻离心高速冷冻离心高速冷冻离心匀浆匀浆匀浆匀浆超滤浓缩超滤浓缩超滤浓缩超滤浓缩电泳脱色电泳脱色电泳脱色电泳脱色作业题：已知某蛋白的分子量约为17kDa，等电点3.94.1，它能耐一定的高温，在90C加热34min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由，以及检测方法。