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1、发酵工艺学原理复习题参考答案发酵工艺学原理复习题参考答案（20112011 级）级）第二章第二章1.1.比较固体培养与液体培养的优缺点。比较固体培养与液体培养的优缺点。固体培养 优点：（1）酶活力高。（因为菌丝体密度大）（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。缺点：（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。（2）周期长。（3）培养过程中环境条件控制较难。（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。液体培养 优点：（1）生产效率高，便于自动化管理。（2）生产过程中温度、溶氧、pH 值等参
2、数可以实现全面控制。（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。缺点：（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。2.2.说明菌种扩大培养的条件。说明菌种扩大培养的条件。菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。1.培养基：种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生
3、物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。2.温度 种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。需要指出的是：（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物合成温度为 32-34（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。3.氧的供给 菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗
4、的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等4.pH 值 菌种扩大培养的 pH 值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：（1）扩培选择的 pH 值是菌体的最适生长 pH 值，往往与发酵最适 pH 值不同。（2）培养基灭菌后，通常其 pH 值要下降 0.51.0 个单位3.3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？菌种扩大培养的目的和意义是什么？（1）提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。目的是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）b、为了使培养菌在数量
5、上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。（2）让菌种从固体试管、液体试管、三角瓶、种子罐、发酵罐逐级扩大，逐步适应大环境的生产。（3）菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，增加了生产的可靠性。4.4.工业生产用菌种的基本要求有什么？工业生产用菌种的基本要求有什么？（1）具有稳定的遗传学特性（2）微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求（3）生长条件易于满足（“临界溶氧浓度”pH 值等）（4）对于细菌，希望具有抗噬菌体的能力。（5）具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵
6、周期，降低生产成本。（6）对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。5.5.微生物发酵常用的菌种有哪些？微生物发酵常用的菌种有哪些？1.细菌类：短杆菌：GA,Gln,lys枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温-淀粉酶)-Amylase 苏云金芽孢杆菌：BT 生物农药梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵2.酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵
7、酒精酵母：汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母：scp 生产，石油发酵3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色素的生产；豆腐乳的生产等赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等第三章第三章1.1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？（1）淀粉及其水解糖液（2）含有淀粉及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等（3）化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等（4
8、）纤维素2.2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？无机氮源:氨水、尿素（有脲酶微生物）、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL 等有机氮源:豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白、玉米蛋白粉等3.3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？酸法水解的主要副产物是淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？酸法水解的主要副产物是什么？什么？淀粉的水解淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法。酸法:（优）生产方法简单易行；对设备要求简单；水解时间短；生产能力大。（缺）反应条件比较强烈；产生的副产物较多。双酶法：（1）
9、酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。双酶法淀粉水解首先使用耐高温-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。（2）淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高 10%以上。（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到 20Be 以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有 12Be。酸法水解的主要副产物:（1）双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖。前者不利于产物的结晶提出；后者对于菌体的生长有抑制作用。（2）一分子葡萄糖
10、脱水，形成 5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。（3）一分子葡萄糖和-NH2 反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。4.4.双酶法淀粉的水解通常使用哪双酶法淀粉的水解通常使用哪 2 2 种酶？其作用特点分别是什么？种酶？其作用特点分别是什么？-淀粉酶:又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉-1，4 葡萄糖苷键，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖，因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。淀粉-1，4；1，6 葡萄糖苷酶:又称糖化酶，可以水解淀粉分子的-1，4 或-1，
11、6 葡萄糖苷键，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。5.5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。借助蒸汽释放的热能使微生物细胞内蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，致使微生物死亡。在
12、有水分存在的情况下蛋白质更易受热而凝固变性。湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。理论灭菌时间:t=2.303/k*lnN0/NS实际生产中:间歇灭菌:12120-30min 连续灭菌:13715-30s 在维持罐中保温 8-20min 6.6.生物反应器灭菌的操作要点有什么？生物反应器灭菌的操作要点有什么？将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：（1）定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。（2）培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气，当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的
13、所有管道处于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。（3）培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到 100时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到 100时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。（4）注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。（5）保温期间，要求罐压：0.090.10MPa，温度：118121，时间：30 分钟。（6）灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。（7）配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增
14、加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。7 7以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。的原因。培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：lg(k2/k1)/lg(k,2/k,1)=E/E,(5)实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能 E 的值为E,=8.3683.6*103 J/mol 而菌体死亡的活化能 E 芽孢：E=418*103 J/mol E=无芽孢：
15、E=209250*103 J/mol 显然，（5）式的比值 1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常数增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。8 8掌握以下几个概念：掌握以下几个概念：理论灭菌时间理论灭菌时间：理论计算中培养基的灭菌过程所用的时间t=2.303/k*lnN0/NS 式中N0，NS：分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）-k:表示灭菌过
16、程中菌体死亡的速度常数对数残留定律对数残留定律：即微生物的热致死规律，在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论，在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残量的减少而降低。dN/dt=K*N 实消：实消：将配置好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程。优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。空消：空消：在生物反应器内没有物质时对其进行灭菌。意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消
17、。连消连消:将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。优点:营养成分破坏少，生产效率高；热综合利用率高；大型企业自动化程度高。第四章第四章1.1.基本概念：基本概念：能荷：能荷：生物体所具有的能量水平。能荷=（ATP+1/2ADP）/（ATP+ADP+AMP）显然，能荷在 01 之间。甘油发酵：甘油发酵：在厌氧或好氧条件下培养酵母，利用糖分解生成甘油的过程。侧系呼吸链：侧系呼吸链：NAD(P)H 经过该呼吸链，可正常传递 H+，将其氧化为 H2O，但是并没有氧化磷酸化生成 ATP，不能够正常产生 ATP 的呼吸链称之为侧系呼吸链。标准呼吸链：标准呼吸链：NA
18、D(P)H 经过该呼吸链，可正常传递 H+，将其氧化为 H2O，并能正常氧化磷酸化生成 ATP 的呼吸链称之为标准呼吸链。二氧化碳固定化反应：二氧化碳固定化反应：二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程初级代谢：初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物统称之为：初级代谢产物。次级代谢：次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。分叉中间体：分叉中间体：处于代谢的分叉点上，既可以
19、合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，把微生物的初级代谢和次级代谢紧密联系起来的物质。发酵逆转：发酵逆转：发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源或碳源或改变发酵条件，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成，这种现象称之为发酵逆转。反馈抑制：反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。协同反馈抑制：协同反馈抑制：就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。营养缺陷型：营养缺陷型：某些菌株发生突
20、变后，失去合成某些对该菌株生长必不可少的物质的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。抗性突变株：抗性突变株：是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。分解代谢阻遏：分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。又称之为葡萄糖效应。代谢控制发酵：代谢控制发酵：是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。DCADCA 循环循环:在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶
21、 A 参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。2.2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。甘油厌氧发酵的缺点：a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；b.转化率较低，实际转化率远低于 50%。c.由于残糖的存在，导致甘油的提出率更低。（我们国家没有超过 70%。）好氧发酵：优点：在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过 TCA 循环来增加其产能水平，一方面减少 3磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率
22、，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。缺点：这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行 TCA 循环的同时，也增加了 TCA 循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响。3.3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？C6H12O6（1）点：EMP 畅通无阻控制 Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸对 PFK的抑制 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活丙酮酸+丙酮酸（2）点：通过 CO2固定反应生成 C4二羧酸，强化这一反应的方法：添加辅酶生物素乙酰辅酶 A+C4二羧酸（3）点:柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基中的 Fe2+的浓度柠
23、檬酸4.4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。在柠檬酸产生菌体内存在一条侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20 分钟，根据处理情况如：紧急保压等）。则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的 ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象在生产上通常称之为：只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败。5.5.简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。简述二
24、氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。葡萄糖经过 EMP 途径生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶 A(CH3CO-CoA)，则合成一分子柠檬酸需要 3 分子的 CH3CO-CoA，也就是需要1.5 分子的葡萄糖；如果其中一分子的丙酮酸通过 CO2 固定反应生成一分子的 C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要 1 分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。6.6.比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。优点：（1）细菌菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小
25、时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA 的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。（4）对于细菌的诱变与选育手段多，改变细菌的遗传特性很容易，对酵母菌的诱变需剥离开细胞壁与细胞膜。缺点：（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。（3）细菌发酵易感染噬菌体。7.7.写出
26、大肠杆菌中写出大肠杆菌中 LysLys 代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产 Lys Lys 的菌种特性和控制要点。Glucose EMP 丙酮酸草酰乙酸Asp(天冬氨酸激酶 AK，同功酶)天冬氨酸磷酸（asp-p）天冬氨酸-半醛（同功酶）二羟吡啶羧酸高丝氨酸（Hos）Lys 琥珀酰高丝氨酸O-磷酸高丝氨酸Met Thr 大肠杆菌赖氨酸代谢特点：天冬氨酸激酶是一个关键酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met 和 Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp 激酶的活性才能完全被抑制。控制要点：要使菌体合成并积累 Lys，可以选育 Hos
27、-，这样的话，既可以解除 天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向 Lys 的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要-的是由于 Hos，使得代谢过程中不可能产生过量的 Met、Thr，尽管产生了大量的 Lys，Lys可以抑制关键酶天冬氨酸激酶 1，但是天冬氨酸激酶 2、3 的活性由于 Met、Thr 的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸 半醛，仍可以大量的生成，这就保证了 Lys 的生物合成途径的畅通无阻。8.8.写出黄色短杆菌中写出黄色短杆菌中 LysLys 代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产 LysLys 的菌种的菌种特性和控制要点。特性和控制
28、要点。Glucose EMP 丙酮酸草酰乙酸Asp(天冬氨酸激酶，AK)天冬氨酸磷酸（asp-p）天冬氨酸-半醛二羟吡啶羧酸高 丝 氨 酸珀酰高丝氨酸Lys O-磷酸高丝氨酸Met Thr 特点：（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受 Lys、Thr 的协同反馈抑制。（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（），即优先合成 Hos，然后再优先合成 Met，当 Met 过量时，阻遏：催化 Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成 Thr 的方向进行，当 Thr 过量时，反馈抑制：Asp-半醛Ho
29、s所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向 Lys 的合成上。控制要点：根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产 Lys，需要选用 Hos-，尽管，从理论上讲，选育 Hos-进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给 Thr，则 AK 酶的活性不会受到Lys 的反馈抑制，实际上 Lys 对 AK 酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的 Lys 发酵，仅仅选育 Hos-是不够的但是为了高效率的转化 Lys，可以选育结构类似物抗性突变株：(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株AECr (2)-甲基赖氨酸抗性突变株MLr（3）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性
30、突变株ThrHxr 使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met-+Thr-）,其本质上和 Hos-是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。9.9.谷氨酸发酵生产过程中，主要出现哪些异常现象？其危害是什么？产生的原谷氨酸发酵生产过程中，主要出现哪些异常现象？其危害是什么？产生的原因是什么？如何处理？因是什么？如何处理？1.发酵前期 pH 值过高危害：影响菌体正常生长；发酵周期延长；成本增加；易发生菌体自溶。影响因素：（1）耗糖速度过慢（就是糖的代谢速度过慢）（2）初脲量大，菌种脲酶活力高导致铵离子浓度高（3）感染 ph
31、age(4)培养基中缺乏磷酸盐等处理方法：（1）耗氧速度慢，通过测定糖的含量确定，可以强化通风，适当添加生物素等（2）初脲量大，停止通风，或者小通风，以使尿素缓慢释放铵离子（3）感染 phage（4）缺乏磷酸盐2.初期 pH 值偏低危害：影响菌体正常生长；发酵周期延长；成本增加；易发生菌体自溶。影响因素及处理方法：（1）初脲添加量不够，提前酌情流加尿素（2）泡尿（3）培养基中的磷酸盐过高，代谢平衡被打破，酸性产物的积累（4）供氧不足通风量搅拌转速发酵罐压力结构参数（挡板空气分布器搅拌桨形式）3.接种后菌体生长不良，OD 值偏低，耗糖速度减慢危害：发酵周期长；菌体活力低；核酸转化率偏低原因：（1
32、）可能感染 phage（2）培养基存在问题：缺乏磷酸盐、缺乏生物素、存在抑制菌体生长的物质淀粉水解产生的抑制性物质：龙胆二糖培养基灭菌产生的抑制性物质（3）通风量过大，溶氧水平高。使得菌体耗糖速度降低（4）种子不良，种子衰老，接种温度过高导致菌体被烫死（5）前期通风较少，pH 值偏低，代谢产物积累较多的酸性物质，不利于菌体的生长4.中后期，OD 值继续升高，耗糖快，但是产酸很低危害：只长菌不产酸原因：（1）生物素浓度过高（2）感染杂菌，可通过镜检初步判断是否感染杂菌5.发酵中后期 pH 值偏低，耗糖快，但是产酸低或不产酸原因：（1）感染杂菌（2）供氧不足，导致酸性产物的积累（3）生物素浓度过高
33、，磷酸盐浓度过高，导致 OD 值增长太快处理方法：大量的通风、提前流加尿素6.发酵过程中发酵液泡沫太多原因：（1）淀粉质量差，杂质多，蛋白质含量高（2）糖化不完全，糖化液中含有糊精（3）糖化工艺不合理，复合物形成过多（4）感染杂菌（5）泡敌选择不理想7.发酵过程中，产酸后，GA 又下降原因：（1）pH 过高，谷氨酰胺合成酶活性下降（2）感染杂菌8.谷氨酸浓度急剧增加原因：感染 phage 10.10.写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明 COCO2 2固定化反应的重要性。固定化反应的重要性。Glucose EMP 丙酮酸+丙酮酸CO2CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶
34、）乙酰辅酶 A +C4二羧酸苹果酸（苹果酸激酶）柠檬酸（DCA 循环封闭）谷氨酸体系不存在 CO2 固定反应：3/2 C6H12O6+NH4+=C5H9O4 +4 CO2 产率：147/（180*3/2）=54.4%体系存在 CO2 固定反应：C6H12O6 +NH4+=C5H9O4 +CO2 产率：147/180=81.7%可见，在 GA 的生物合成过程中，CO2 固定反应对于产率的提高有着重要的作用。11.11.谷氨酸产生菌之所以能够合成、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的积累并分泌大量的 GAGA，其菌种内在的原因有其菌种内在的原因有哪些？哪些？1.KGA 脱氢酶酶活性微弱或丧
35、失 这是菌体生成并积累 KGA 的关键，KGA 是菌体进行 TCA 循环的中间性产物，由 KGA 进行还原氨基化生成 GA 的可能性很小。只有当体内 KGA 脱氢酶活性很低时，TCA 循环才能够停止，KGA 才得以积累。2.GA 产生菌体内的 NADPH 的再氧化能力欠缺或丧失（1）NADPH 是 KGA 还原氨基化生成GA 必须物质，而且该还原氨基化所需要的 NADPH 是与柠檬酸氧化脱羧相偶联的。（2）由于 NADPH 的再氧化能力欠缺或丧失，使得体内的 NADPH 有一定的积累，NADPH 对于抑制 KGA 的脱羧氧化有一定的意义。3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸
36、裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现 DCA 循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现 GA 发酵的首要条件。4+4.菌体有强烈的 L谷氨酸脱氢酶活性KGA+NH+NADPH=GA+NADP L 谷氨酸脱氢酶，实质上 GA 产生菌体内该酶的酶活性都很强，该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联5.GA 产生菌的细胞膜通透性能够得到有效的调节和控制，将 GA 胞内产品变为胞外产品（1）解除了 GA 对 GA 脱氢酶的反馈抑制，有利于 GA 大量合成（2）降低了 GA 的分离成本12.12.谷氨酸产生菌之所以能够在谷氨酸产生菌之所以能够在 1
37、0%10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的以上的葡萄糖培养基上，生产大量的 GA,GA,除除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？1.培养基成分主要是玉米浆浓度的控制2.供氧浓度过量：NADPH 的再氧化能力会加强，使 KGA 的还原氨基化受到影响，不利于 GA 的生成。供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的 pH 值下降，不利于 GA 的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。4+3.NH 浓度（1）影响到发酵液的 pH 值（2）与产物的形成有关：过低，不利于 KGA 的还原氨基化 过高
38、，产生谷氨酰胺NH4+的供给方式：（1）液氨（2）流加尿素4.磷酸盐过量：（1）促进 EMP 途径，打破 EMP 与 TCA 之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等（2）产生并积累 Val。Val可以抑制葡萄糖丙酮酸，使 GA 的生物合成受到阻止消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率发酵液中的 Val 存在，严重的影响 GA 的结晶、提出。5.金属离子Mg2+Mn2+13.13.谷氨酸发酵过程中，生物素（谷氨酸发酵过程中，生物素（V VH H）作用表现在那几个方面？）作用表现在那几个方面？1.生物素对发酵液 pH 的影响生物素对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化乙酰辅酶 A 的生成 也有促进作用，但两
39、者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的 VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸生成，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的 pH 值下降。可以通过控制生物素的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。2.生物素对菌体生长的促进作用当 VH 缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当 VH 丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则 DCA 循环正常进行，DCA 循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能荷水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于
40、菌体的增殖和生长，则 GA 的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。以上分析说明，GA 发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。3.生物素对菌体细胞膜通透性的影响生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。在生物体内脂肪酸的合成途径中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是 VH，VH 在此反应过程中起到传递 CO2的作用。当
41、培养基中 VH 的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。14.14.生物素（生物素（V VH H）如何封闭乙醛酸循环的？）如何封闭乙醛酸循环的？DCA 循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：为醋酸诱导受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制这样，当 VH 缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于 VH 对 TCA 循环的促进作用)，则：乙酰辅酶 A 的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；（2）VH 对 TCA 循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，D
42、CA 循环得到封闭。15.15.微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些变化？这些变化的本质是由什么引起的？变化？这些变化的本质是由什么引起的？庆大霉素的发酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短；地衣芽孢杆菌由原来生长期的粗短型转变成细长。这与同样是细菌发酵的谷氨酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态由细长变为粗短。外观：菌体停止生长但形态发生变化，变大 OD 值变大。本质：某些营养成分成为限制性因子1616、细菌细胞膜通透性的调节方式都有哪几种
43、？调节的意义是什么？、细菌细胞膜通透性的调节方式都有哪几种？调节的意义是什么？（1）改变膜的组成与结构，使之成为不完整的细胞膜（2）破坏细胞壁的合成，使之不能合成完整的细胞壁，细胞膜由于缺乏细胞壁的机械保护作用可以改变其渗透性。（3）通透性酶活性的调节与控制:细胞膜对于要输送的物质具有高度的选择性，这种高度选择性与通透性酶的活性、结构有着直接的关系，而透性酶与其他酶相同，也有着自己的调节与控制机制。研究这种机制，有利于提高微生物的代谢产物的过量生产。意义:细胞膜通透性的调节对于 GA 发酵是非常重要的，当菌体进入产物合成期时，开始有GA 的产生，这时如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可
44、以解除 GA 对 L谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由 Glucose 到 GA 的高效率转化第五章第五章1.1.基本概念基本概念发酵热：发酵热：发酵过程中，由于菌体对培养基利用而发生的生物反应及搅拌时产生的摩擦等等，都会产生一定的热量。同时罐壁的散热、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热 Q 发酵热=Q 生物热+Q 搅拌热+Q 蒸发热+Q 辐谢热生物热：生物热：微生物在生长过程中，由于培养基中的营养性物质：糖、蛋白质、脂肪等被氧化，同时产生大量的热量，这些热量一部分用于合成高能物质（ATPGTP）等，这些高能物质用于菌体自身的生长、繁殖上；剩余的另一部分，
45、则以热的形式散发出来，其表现在外观上，就是使培养基的温度升高，这一部分热量称之为生物热。发酵动力学类型：发酵动力学类型：发酵过程中菌体生长与底物消耗及产物合成之间不同的动力学关系，分为生长相关型、混合生长相关型和非生长相关型三种。生长相关型发酵：生长相关型发酵：产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物混合生长相关型发酵：混合生长相关型发酵：产物生成速率与细胞生长速率间接相关，产物的生长是细胞能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物。非生长相关型发酵：非生长相关型发酵：产物的生成与细胞的生长无关联的发酵模式，细胞生长时无产物的生成，但细胞停止生长后，大量产物生成
46、并积累，产物的生成速率只与细胞积累量有关。氧传递动力学方程：氧传递动力学方程：dc/dt=kLa(c*-c)也可以写成以（P*-P）为推动力的氧传递方程式：dc/dt=kLa（P*-P）式中：dc/dt溶氧速率，mol/m3.h kLa体积溶氧系数，1/h c*与气相中氧的分压呈平衡的液相中的氧的浓度，也就是一定体系下的液相中的最大的溶氧浓度，mol/m3 c液相中氧的实际浓度，mol/m3 氧传递的双膜理论：氧传递的双膜理论：（1）溶氧过程存在一个界面，这个界面的厚度可以忽略不计。在这个界面上，气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓度呈平衡关系，即 Pi 与 Ci 呈平衡关系，符合亨利定律：Ci=
47、K*Pi（2）传质过程是一个稳定的过程，各点氧的浓度不是时间的函数。（3）气膜、液膜都以层流状态存在。2.pH2.pH 值对微生物生长的影响主要表现在那几个方面？值对微生物生长的影响主要表现在那几个方面？1.pH 值影响到了酶的活性，不同的酶有其最适合的 pH 值，当菌体中的酶系处于不适合的pH 值环境时，必然影响到其代谢活动。2.pH 值影响了菌体细胞膜的带电状态，从而影响了细胞膜的渗透性，必然就会影响营养物质的吸收与代谢产物的排泄。3.pH 值影响 Medium 中的营养成份和中间性代谢产物的电离状态，从而影响了 M 对这些物质的正常利用。4.pH 值不同，其菌体代谢途径也会发生变化，代谢
48、产物也不同。5.pH 对细胞形态的影响这实际上是 pH 值对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏观）表现3.3.说明发酵过程中泡沫的消长规律说明发酵过程中泡沫的消长规律通常，在发酵初期，由于培养基中的大量的发泡物质的存在，使得泡沫较多，但这时的泡沫大，易破碎；随着菌体的大量的增殖，以及大量的发泡物质被消耗，发酵过程中有一段时间泡沫很少；当菌体进入对数生长期后，由于菌体呼吸强度的增加，泡沫越来越多；当菌体进入产物合成期后，发酵液的泡沫仍然继续增加，这主要是由于菌体合成的产物增加了发酵液的粘度；发酵后期，由于大量的菌体的死亡以及死亡菌体细胞的菌体自溶，使得发酵液中的大分子蛋白质浓度增加，泡沫更为严重。
49、4.4.选择化学消泡剂的原则是什么？化学消泡主要有什么缺点？选择化学消泡剂的原则是什么？化学消泡主要有什么缺点？（1）对发酵过程中的微生物的生长和代谢无副作用，对人、动物无毒性。（产品人用，母液用于饲料的生产）（2）能够迅速的消泡，对泡沫的控制持久性好。（3）高温灭菌不变性，在高温灭菌的温度下，对设备无腐蚀，也不产生腐蚀性的物质。发酵过程中流加的消泡剂需要先灭菌后流加,培养基中先要加一部分。（4）对产品的后述操作不产生不利的影响。（5）不干扰发酵过程中的分析系统的正常工作，DO、PH 等（6）对氧的传递不产生不利的影响。（7）来源丰富，价格低廉。（8）分散性还好，有利于泡沫的控制。1.天然油脂
50、类主要有：玉米油、豆油、棉籽油、花生油等优点：价格便宜，来源较广泛，在中间加入后可以作为微生物的 C 原使用。缺点：不能一次性的加入的过多，否则，各种油脂会被脂肪酸酶分解成各种脂肪酸，造成发酵液的 PH 值的下降。油脂易氧化，氧化了的油脂对微生物的生长和代谢可能带来抑制作用。2.聚醚类：生产上应用较多的是：聚氧乙烯氧丙烯甘油，又称为泡敌（GPE），其使用量在0.3-0.35%，消泡能力为天然油脂的 10 倍以上。聚氧丙烯（GP)也是一种消泡剂，其与环氧乙烷加成则生成聚氧乙烯氧丙烯（GPE）泡敌，前者，具有良好的抑跑能力，后者，具有良好的消泡能力。在实际生产中，可以考虑两者共同使用。3.硅酮类：