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1、生物化学实验22 核酸的定量测定-定糖法电子课件 生物化学实验技术生物化学实验技术核酸的定量测定定糖法（地衣酚法）实验类型：实验类型：实验类型：实验类型：验证性验证性验证性验证性教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：3 3生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的学习学习和掌握测定和掌握测定RNA含量的定糖法（地含量的定糖法（地衣酚法）的原理和操作技术衣酚法）的原理和操作技术生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理核糖核酸核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与形成的核糖继而转变成糖醛，后者与3,5-二二羟羟基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，
2、该反应需用基甲苯（地衣酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收，处有最大吸收，RNA浓度在浓度在20200g/mL范围范围内，吸光度与内，吸光度与RNA的浓度成正比关的浓度成正比关系。系。生物化学实验技术地衣地衣酚法只能测定酚法只能测定RNA中与嘌呤连接的核中与嘌呤连接的核糖，不同来源的糖，不同来源的RNA所含嘌呤与嘧啶的比例各所含嘌呤与嘧啶的比例各不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种不相同，因此，用所测得的核糖量来换算各种RNA的含量存在误差。最好用被测样品相同来的含量存在误差。最好用被测样品相同来源的纯化
3、源的纯化RNA作作RNA-核糖标准曲线，然后从核糖标准曲线，然后从曲线求得被测样品的曲线求得被测样品的RNA含量。含量。生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、仪器：试管及管架、仪器：试管及管架、水浴锅、水浴锅、移液管、移液管、可见光可见光分光光度计分光光度计。2、试剂、试剂：RNA标准溶液，标准溶液，RNA样品溶液，样品溶液，0.1%地衣地衣酚酚试剂。试剂。生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容1、RNA标准曲线的制作标准曲线的制作取取6支试管，编号，按下表加入支试管，编号，按下表加入试剂。试剂。试剂试剂123456RNA标准液标准液/mL00.40.81.21.62.0蒸馏水蒸馏
4、水/mL21.61.20.80.40地衣酚试剂地衣酚试剂/mL222222A670生物化学实验技术加毕加毕，摇匀，置沸水浴中加热，摇匀，置沸水浴中加热15分钟，冷分钟，冷却，测却，测A670nm值。以值。以A670nm值为纵坐标，值为纵坐标，RNA浓度（微克浓度（微克/毫升）为横坐标作图绘制标准曲毫升）为横坐标作图绘制标准曲线。线。生物化学实验技术生物化学实验技术3、无机磷的测定、无机磷的测定吸取吸取样液（样液（2mg/mL）1.0mL，置于，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0mL置试管中，加定磷试剂置试管中，加定磷试剂3.0mL，45水水浴中保温浴中保温10min，测，测A660nm。生物化学实验技术