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1、生物化学(shnwhuxu)与分子生物学专业XXX邮箱:葡萄糖氧化酶法测定血糖(xutng)浓度第一页，共二十三页。1.掌握(zhngw)血糖测定原理，计算方法，参考正常值，临床意义。2.了解尿糖的测定(cdng)及意义。1.收集耳缘静脉血,制备血浆(xujing),葡萄糖氧化法比色测定血糖浓度。2.收集尿液,班氏法测定。一.实验要求 二.实验内容 第二页，共二十三页。血糖blood glucose,BG指血浆清中的糖类物质，主要(zhyo)为葡萄糖。一.血糖的来源：食物、糖原的分解、糖异生。二.血糖的去路：有氧氧化、转换成非糖物质、尿排出、糖酵解。血糖血糖(xutng)第三页，共二十三页。1
2、.正常(zhngchng)血糖浓度:3.9-6.1mmol/L(成年人空腹)低血糖:低于2.8mmol/L高血糖:超过7.8mmol/L2.低血糖的因素：胰岛素、磺脲类药、饮酒、严重饥饿高血糖的因素：进食、情绪紧张时、糖尿病.3.糖尿病的诊断和治疗监视、新生儿低血糖症等.第四页，共二十三页。肾上腺素由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素(j s)。肾肾上腺素升高血糖机制：上腺素升高血糖机制：在应激状态、内脏神经刺激和低血糖等情况下，肾上腺素被释放入血液循环，促进糖原分解并升高血糖，促进脂肪分解，促进非糖物质向血糖的转化，使血糖浓度增大。肾上腺素上腺素adrenaline;epinephrine 第
3、五页，共二十三页。一、血糖一、血糖(xutng)测测定定福林-酚试剂(shj)法葡萄糖氧化酶法邻甲苯胺(bnn)法第六页，共二十三页。葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶法原理法原理(yunl)葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶酶 GOD 氧化氧化(ynghu)，37oCH2O2 苯酚苯酚(bn fn)4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉H2O 红红色色醌亚胺 +O237oC 辣根辣根过过氧化物氧化物酶酶 POD Trinder反响反响溶液在505nm下有吸收峰,可用比色法测定,得出葡萄糖的浓度。第七页，共二十三页。标准(biozhn)浓度法A标=KC标LA样=KC样LC样=A样A
4、标C标第八页，共二十三页。【试剂】酶酚混合(hnh)试剂PH7.05mmol/L葡萄糖标准应用液班氏试剂【器材】试管、试管架、吸量管、移液枪、恒温水浴(shu y)、722型分光光度计。实验实验(shyn)前准前准备备【标本】1.血浆 应在血液采集1小时内尽早别离。第九页，共二十三页。具体操作具体操作 1 称重；称重；2 取血：取血：找到耳找到耳缘缘静脉，二甲苯擦拭，涂薄静脉，二甲苯擦拭，涂薄层层凡士林凡士林 有何有何作用作用。用三棱用三棱针针刺破耳刺破耳缘缘静脉放血静脉放血(自然自然(zrn)血流血流)，将，将血液收集于草酸血液收集于草酸钠钠抗凝管内抗凝管内 边边接接边摇边摇,以防凝固以防凝
5、固，取取约约5ml。离心，离心，2000rpm，10min，取上清，取上清，编编号；号；3 注射激素后再取血注射激素后再取血:皮下注射皮下注射肾肾上腺素上腺素(0.4mg/kg体重体重)，记录记录在注射在注射时间时间。30min后取血后取血5ml于抗凝管内于抗凝管内,离心，离心，2000rpm，10min，取上清，取上清，编编号。号。第十页，共二十三页。4取4支试管，按下表参加(jir)试剂:标准标准(ml)正常正常(ml)注射后注射后(ml)空白空白(ml)血清样品血清样品葡萄糖标准液葡萄糖标准液蒸馏水蒸馏水酶酚混合试剂酶酚混合试剂0.023.000.023.000.023.000.023.
6、00 将各管充分混匀，37 水浴中保温15min；取出冷却至室温后，505nm处比色；以空白管调零，读取标准(biozhn)管及测定管光密度值。第十一页，共二十三页。计算(j sun)：测测定定(cdng)管葡萄糖含量管葡萄糖含量 mmol/L 测定测定(cdng)(cdng)管光密管光密度度 标准管光密度标准管光密度51.注射前后的血糖浓度2.注射后血糖浓度增高率A A肾肾-A-A正正 A A正正 100%增高率增高率 =第十二页，共二十三页。结果果(ji gu)记录标准标准(ml)正常正常(ml)注射激素后注射激素后(ml)空白空白(ml)A血糖浓度增高率第十三页，共二十三页。尿糖是指尿中
7、的糖类，主要(zhyo)是指尿中的葡萄糖。正常情况下，肾小管能将肾小球滤过的葡萄糖全部重吸收回血液，当血糖肾糖阈8.96-10.08mmol/L,超过肾小管的重吸收能力,局部葡萄糖随尿排出。尿糖的测定虽然不能单纯作为糖尿病的诊断标准，但是从某种层面上也能反映一些问题。血血浆浆(xujing)尿糖尿糖尿糖尿糖动脉血血细胞、大分子蛋白质等局部(b fen)水、无机盐、葡萄糖、维生素、尿素等重吸收近端小管二、二、二、第十四页，共二十三页。1.班氏定性试验：2.葡萄糖氧化酶试纸(shzh)法干化学法：反响原理同血糖葡萄糖氧化酶法。尿糖尿糖测定定(cdng)第十五页，共二十三页。班氏定性班氏定性试验试验
8、原理：原理：利用葡萄糖或其它复原性物利用葡萄糖或其它复原性物质质在碱性在碱性(jin xn)(jin xn)高温高温环环境中，将反境中，将反响液中响液中Cu2+Cu2+复原复原为亚铜为亚铜离子离子Cu+Cu+，形成黄色的，形成黄色的氢氢氧化氧化亚铜亚铜或或红红色的氧色的氧化化亚铜亚铜。根据。根据显显色的程度，可色的程度，可对对尿葡萄糖作定性及半定量尿葡萄糖作定性及半定量检测检测。(CHOH)(CHOH)n nCHOCHOCHCH2 2OHOH+2Cu2Cu2+2+4OH4OH-COOHCOOH(CHOH)(CHOH)n nCHCH2 2OHOH+2CuOH+H H2 2O O2CuOHH H2
9、 2O O+CuCu2 2O O醛醛糖糖醛醛糖酸糖酸黄色黄色(hungs)(hungs)或或红红色色第十六页，共二十三页。操作步骤20滴班氏剂A尿液2滴B尿液2滴煮沸5min煮沸5min第十七页，共二十三页。葡萄糖含量葡萄糖含量(g/L)试试管管变变化化结结果符号果符号无糖试剂仍清晰呈蓝色，如有多量尿酸存在也可能少许蓝灰色沉淀微量0.5以下仅冷却后有少量绿色沉淀+少量0.51煮沸约1min后，出现少量黄绿色沉淀+中等量12煮沸约15s，即呈土黄色沉淀+多量2以上开始煮时，即呈多量红棕色沉淀 +第十八页，共二十三页。【本卷须知】操作到位，取量要准确，吸量管不能混用。血清别离后要及时的测定以免影响
10、实验结果。试剂中含叠氮钠0.95 g/L为防腐剂。不可入口！防止接触皮肤及粘膜。应采取必要(byo)的预防措施使用试剂。第十九页，共二十三页。结果(ji gu)分析三.测定的血糖浓度异常：反响不彻底引起(ynq)的偏低葡萄糖标准溶液浓度有问题偏高或偏低移液器引起的偏高或偏低一.结果可报告(bogo)范围：本法对葡萄糖的检测范围为0.0622.2 mmol/L。当样品测定值超过上限时，应将样品用9 g/L氯化钠溶液作1+4稀释，重新测定，结果乘以5。二.当样品中抗坏血酸浓度 852 mol/L，胆红素浓度 684 mol/L，血红蛋白浓度 2.00 g/L，甘油三酯浓度 22.6 mmol/L时
11、没有观察到干扰。第二十页，共二十三页。本法测定葡萄糖非常(fichng)特异，从原理反响式中可知第一步是特异反响，第二步特异性较差。误差往往发生在反响的第二步。一些复原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反响过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。1 葡萄糖葡萄糖O2H2O葡萄糖酸葡萄糖酸H2O2 2 H2O24-氨基氨基(nj)安替吡啉苯酚安替吡啉苯酚H2O 红红色色(hngs)醌醌式物式物质质过过氧化物氧化物酶酶 POD Trinder反响反响【讨论】第二十一页，共二十三页。【思考【思考题】1.为什么要在饥饿条件下采血？血糖主要来
12、源是食物，进食(jnsh)会增高血糖浓度。2.除糖尿病外，假设血糖浓度测定结果不正常可考虑哪些原因？注射葡萄糖、饮食、糖代谢疾病、应激反响3.本法测定血糖为何不需制备血滤液？血滤液除蛋白，对血糖测定没有影响。4.为什么取血前要涂凡士林？起润滑，防渗血作用。第二十二页，共二十三页。内容(nirng)总结生物化学与分子生物学专业。1.收集耳缘静脉血,制备(zhbi)血浆,葡萄糖氧化法比色测定血糖浓度。葡萄糖O2H2O。溶液在505nm下有吸收峰,可用比色法测定,得出葡萄糖的浓度。A样=KC样L。4取4支试管，按下表参加试剂:。以空白管调零，读取标准管及测定管光密度值。A肾-A正。尿糖的测定虽然不能单纯作为糖尿病的诊断标准，但是从某种层面上也能反映一些问题。2.葡萄糖氧化酶试纸法干化学法：反响原理同血糖葡萄糖氧化酶法第二十三页，共二十三页。