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1、生物化学实验29 大蒜细胞SOD的提取与分离电子课件 生物化学实验技术生物化学实验技术大蒜细胞SOD的提取与分离实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：6 6生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的通过通过大蒜细胞大蒜细胞SOD的提取与分离，学习的提取与分离，学习和掌握作方法。蛋白质和酶的提取与分离的和掌握作方法。蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和基本原理和操作。操作。生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它化、抗衰老、抗辐
2、射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子进行歧化反应，生成氧和过可催化超氧负离子进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可，通过组织或细胞破碎后，可用用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于磷酸缓冲液提取出。由于SOD不溶于不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。生物化学实验技术核黄素核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负在有氧条件下能产生超氧自由基负离子，当加入离子，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原
3、自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成蓝色生成蓝色的的二二甲月甲月替。替。当加入当加入SOD时，可以使时，可以使超氧自由基与超氧自由基与H+结合生成结合生成H2O2和和O2，从而抑，从而抑制了制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢速度减慢。生物化学实验技术通过通过在反应液中加入不同量的在反应液中加入不同量的SOD酶液，酶液，光照一定时间后测定波长下各液光密度值，抑光照一定时间后测定波长下各液光密度值，抑制制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正内呈正比比。以以酶液加入量为横坐标，以抑制酶液加入量为横坐标
4、，以抑制NBT光还光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据者相关曲线，根据SOD抑制抑制NBT光还原相对百光还原相对百分率计算酶活性。找出分率计算酶活性。找出SOD抑制抑制NBT光还原相光还原相对百分率为对百分率为50时的酶量作为一个酶活力单位时的酶量作为一个酶活力单位（U）。）。生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、实验材料：新鲜蒜瓣、实验材料：新鲜蒜瓣2、仪器：恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可、仪器：恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒。见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒。3、试剂：、试剂：
5、0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.8），），氯仿氯仿-乙醇混合乙醇混合液，丙酮，液，丙酮，0.05mol/L碳酸盐缓碳酸盐缓冲液（冲液（pH10.2），），0.1mol/LEDTA溶液，溶液，2mmol/L肾上腺素溶液肾上腺素溶液。生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容1、组织细胞破碎：称取、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。钵中研磨。2、SOD的提取：破碎后的组织中加入的提取：破碎后的组织中加入23倍倍体积的体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.8），继），继续研磨续研磨20min，使，使SOD充分溶解到缓冲液中，充分溶解到缓
6、冲液中，然后在然后在5000rpm下离心下离心15min，取上清液。，取上清液。生物化学实验技术3、除杂蛋白：上清液加入、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿体积的氯仿-乙乙醇混合液搅拌醇混合液搅拌15min，5000rpm离心离心15min，得到的上清液为粗酶液。得到的上清液为粗酶液。4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心离心15min，得得SOD沉淀。将沉淀。将SOD沉淀溶于沉淀溶于0.05mol/L磷酸磷酸缓冲液（缓冲液（pH7.8）中，于）中，于5560热处理热处理15min，得到，得到SOD酶
7、液。酶液。生物化学实验技术5、SOD活力测定：将上述提取液、粗酶液和活力测定：将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的酶液分别取样，测定各自的SOD活力。活力。试剂试剂空空白白管管对对照照管管样样品品管管碳酸缓冲液碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液溶液0.50.50.5蒸馏水蒸馏水0.50.5样品液样品液0.5混合均匀混合均匀肾上腺素液肾上腺素液0.50.5生物化学实验技术加入加入肾上腺素后，继续保温肾上腺素后，继续保温2min，然后立，然后立即在即在480nm处测定光密度。对照管和样品管的处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为光密度值分别为A和和B。在在上述条件下，上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：酶活力酶活力（单位）（单位）=2（A-B）N/A式式中，中，N样品稀释倍数；样品稀释倍数；2抑制肾抑制肾上腺素自氧化上腺素自氧化50%的换算系数。的换算系数。