生物化学实验24 质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳电子课件 .pptx

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1、生物化学实验24 质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳电子课件 生物化学实验技术生物化学实验技术质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳实验类型:实验类型:实验类型:实验类型:综合性综合性综合性综合性教学时数:教学时数:教学时数:教学时数:6 6生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的1、掌握从大肠杆菌中制备质粒、掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法,的方法,提供实验所需载体。提供实验所需载体。2、了解琼脂糖凝胶电泳的原理和应用范围,、了解琼脂糖凝胶电泳的原理和应用范围,掌握琼脂糖凝胶电泳分离掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的方法。的方法。生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理(一)质粒(一)质粒DNA的提

2、取的提取 质粒质粒(Plasmid)是存在于细菌染色体外)是存在于细菌染色体外的的DNA分子,其范围大小在分子,其范围大小在1kb至至200kb以上以上不等。它独立于细菌染色体外进行复制和遗传不等。它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常用的载体。提取质粒用的载体。提取质粒DNA也是基因工程和分也是基因工程和分子生物学研究中最常用的实验操作之一。子生物学研究中最常用的实验操作之一。生物化学实验技术(二)琼脂糖凝胶电泳(二)琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳技术是琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯分离、鉴定和提纯DNA片断的

3、有效方法片断的有效方法。在弱碱性条件下,。在弱碱性条件下,DNA分分子带负电荷。琼脂糖凝胶电泳子带负电荷。琼脂糖凝胶电泳是在电场作用下,是在电场作用下,利用琼脂糖的分子筛效应,使利用琼脂糖的分子筛效应,使DNA分子从负极向分子从负极向正极移动。根据正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(分离。借助溴化乙锭(EB)等可以与双链)等可以与双链DNA结结合的作用的染料进行染色,并通过紫外线激发即合的作用的染料进行染色,并通过紫外线激发即可观察被分离可观察被分离DNA片段

4、的位置。片段的位置。生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、材料:大肠杆菌、材料:大肠杆菌E.coli DH5感受态细胞,感受态细胞,pMD18T质粒。质粒。2、仪器:恒温震动培养箱,恒温水浴锅,低、仪器:恒温震动培养箱,恒温水浴锅,低温高速离心机,微量移液器,电泳仪,水平温高速离心机,微量移液器,电泳仪,水平电泳槽,紫外投射仪,紫外分光光度计,细电泳槽,紫外投射仪,紫外分光光度计,细菌培养瓶,菌培养瓶,1.5mL EP管管。生物化学实验技术3、试剂:无水乙醇,氨苄青霉素粉末,、试剂:无水乙醇,氨苄青霉素粉末,DNA marker,琼脂糖,溴化乙锭水溶液,琼脂糖,溴化乙锭水溶液(10m

5、g/mL),),1mmol/L EDTA,Tris-Cl(pH8.0)饱和)饱和苯酚苯酚,溶液溶液,溶液溶液II,溶溶液液III,TE缓冲缓冲液液,LB液体培养基液体培养基,10TAE电泳缓冲电泳缓冲液液,上上样缓冲样缓冲液液,氯仿氯仿/异戊醇异戊醇。生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容(一)质粒(一)质粒DNA的提取(碱裂解法)的提取(碱裂解法)1、将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有、将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2mL LB/Amp液体培养基的液体培养基的10mL试管里,试管里,37振振荡培养过夜,荡培养过夜,1618h。2、取培养的菌液、取培养的菌液1.5mL移至移至1.5mL Ep

6、pendorf管中,管中,8000 rpm离心离心30 sec,尽量除去上,尽量除去上清清。生物化学实验技术3、加入、加入100 L预冷的溶液预冷的溶液I,盖紧,盖紧EP管盖,剧管盖,剧烈振荡,冰上放置烈振荡,冰上放置5min;4、加入、加入200 L新配制的溶液新配制的溶液II,温和翻转,温和翻转EP管管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明),次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明),轻轻混匀内容物,冰上放置轻轻混匀内容物,冰上放置5min;5、加入、加入150 L预冷的溶液预冷的溶液III,将,将EP管盖紧后管盖紧后来回翻转来回翻转23次,混匀后冰上放置次,混匀后冰上放置5min,12 000

7、 rpm离心离心15min;生物化学实验技术6、将上清转移到另一个、将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿:异戊醇各抽提异戊醇各抽提1次,取上清移入一个新的次,取上清移入一个新的EP管;管;7、加入两倍体积预冷的无水乙醇和、加入两倍体积预冷的无水乙醇和1/10体积体积的的NaAc(3mol/L,pH5.2),盖紧,并翻转),盖紧,并翻转EP管数次混匀;管数次混匀;8、室温放置、室温放置5 min后,以后,以12000 rpm离心离心5 min,弃尽上清;,弃尽上清;生物化学实验技术9、加入、加入1mL

8、70%乙醇洗涤管底白色沉淀,吸乙醇洗涤管底白色沉淀,吸去上清,空气干燥或真空抽干;去上清,空气干燥或真空抽干;10、将沉淀溶于、将沉淀溶于20 L TE缓冲液或缓冲液或ddH2O,完,完全溶解后,全溶解后,-20保存;保存;11、提纯质粒的鉴定:紫外吸收检测质粒、提纯质粒的鉴定:紫外吸收检测质粒DNA的浓度和纯度。的浓度和纯度。生物化学实验技术(二)(二)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1、灌胶:将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端,制、灌胶:将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端,制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。取取一烧杯,加入琼脂糖一烧杯,加入琼脂糖1.2 g和和1TB

9、E溶液溶液100 mL,混匀,加热至琼脂糖彻底溶解。待,混匀,加热至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后,加入稍冷后,加入5L饱和的溴乙锭,轻晃混匀,饱和的溴乙锭,轻晃混匀,然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。冷却成胶。生物化学实验技术2、上样电泳:将胶块移入电泳槽,点样孔一、上样电泳:将胶块移入电泳槽,点样孔一侧靠近负极,注入侧靠近负极,注入1TBE缓冲液,浸没凝胶,缓冲液,浸没凝胶,轻轻拔出梳子。加轻轻拔出梳子。加1L上样缓冲液与上样缓冲液与5L质粒质粒溶液混匀,用移液器小心加样。加样时,加样溶液混匀,用移液器小心加样。加样时,加样枪头尖端插入上样

10、孔内枪头尖端插入上样孔内1/3高度,轻轻将样品高度,轻轻将样品推入,使比重较大的样品自然沉入上样孔底。推入,使比重较大的样品自然沉入上样孔底。避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。开启电源,避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部。开启电源,电压调至电压调至100V。通常。通常30min后检查。后检查。生物化学实验技术3、染色:电泳结束后,将凝胶放入溴化乙锭、染色:电泳结束后,将凝胶放入溴化乙锭水溶液中,脱色摇床上染色水溶液中,脱色摇床上染色20分钟。分钟。4、结果观察:置凝胶于长波紫外透射仪上,、结果观察:置凝胶于长波紫外透射仪上,可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、质粒质粒DNA泳道可见泳道可见3个条带。个条带。

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