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1、原代原代细胞培养胞培养实验费晓芳芳v掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。v了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。v了解原代细胞培养的一般方法与步骤。了解原代细胞培养的一般方法与步骤。v了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。v了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。v了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。实验目的和要求：目的和要求：实验原理：原理：v原代细胞培养原代细胞培养v是将机体内的某是将机体内的某组织取出，分散成取出，分散成单细胞，在胞，在人工条件下培养使其生存并不断生人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的、繁殖的方法。借助方法。借助这种方法可以种方法可以观察察细胞的分
2、裂繁殖、胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生胞的衰老，死亡等生命命现象。象。实验内容：实验内容：v动物的选择：动物的选择：选择大大约一半足孕一半足孕时间的胚胎，的胚胎，1013天天龄胚胎含有最大数量的未分化的胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胞，成成纤维细胞可从胞可从这些些细胞衍生胞衍生获得。得。每每组小鼠胚胎小鼠胚胎2-5个个实验材料：实验材料：v每每组的超的超净台中有以下物品：台中有以下物品：v1.50ml 配制好的配制好的RPMI1640培养液培养液1瓶；瓶；8ml小牛小牛血清（血清（FCS)1瓶；瓶；100ml 0.25%胰蛋白胰蛋白酶 1瓶；瓶；
3、PBS(-)1 瓶瓶v2.100ml灭菌菌烧杯杯2个；个；v3、50ml离心筒离心筒2个个v4、灭菌培养皿菌培养皿1个，个，细胞培养瓶胞培养瓶1个个v4、1ml，200l移液器各移液器各1支；支；枪头盒盒2个；无菌个；无菌玻璃玻璃搅拌棒拌棒1个个v5、细胞胞计数板数板1块；v6、灭好菌的好菌的镊子子1把，剪刀把，剪刀1把；把；v7、酒精灯、酒精灯1台；台；试验操作步骤：试验操作步骤：v1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠)v a采用认可的方案处死啮齿动物。采用认可的方案处死啮齿动物。v b立即在无菌超净台内用立即在无菌超净台内用70乙醇擦洗整个
4、动物。乙醇擦洗整个动物。v c用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。无菌镊子将皮肤扯向后腿。v d用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。子宫，置于无菌的培养皿上。v e剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的的100ml烧杯中。烧杯中。v f漂洗胚胎，去掉漂洗胚胎，去掉PBS。继续用。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。液清亮为止。仔细清洗小鼠腹部仔细清洗小鼠腹部
5、v2)将将12个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用用PBS漂洗。漂洗。v3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离的无菌离心筒中心筒中,加入的无菌胰蛋白酶加入的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动用搅拌棒轻轻搅动。v4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 C培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动15分分钟。钟。v5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌细胞的液体转移至一无菌50m
6、l的离心管中，该管内按照的离心管中，该管内按照每每10ml上清加入上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。v6)6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤见前述步骤)于含有残留未消化组于含有残留未消化组织块的原来的织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤4 4和和5 5。v7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r1200rrainrain，5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。v8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤7 7再次离心。再次
7、离心。v9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。v10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素如青霉素、链霉素)的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为再悬沉淀，并使终体积为20ml20ml。v11)11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。v12)为确定现有细胞浓度，加入细胞悬液于为确定现有细胞浓度，
8、加入细胞悬液于1.8ml 1醋酸溶醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞记数方法见传代培养课件）记数方法见传代培养课件）v13)按每细胞瓶按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于细胞的数量接种于10ml组织培养液中，组织培养液中，在饱和湿度的在饱和湿度的37 C02培养箱中孵育直至细胞铺满。培养箱中孵育直至细胞铺满。v14）24小时后即可观察小时后即可观察 。细胞记数细胞记数v1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。重悬于细胞培养液中。v2.用沾有用沾有70%酒精的棉
9、球擦净细胞计数板和酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。v3.用移液器吸取细胞标本用移液器吸取细胞标本10l，加入，加入10l台台盼氏兰溶液混匀，吸取盼氏兰溶液混匀，吸取10l混合液从盖玻片混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。v4.在显微镜下，计数或细胞。在显微镜下，计数或细胞。v5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（和中间的大方格中（5个格）的细胞数。个格）的细胞数。v6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。室计细胞数。v7.合计合计10个大方格中的细胞。算出个大方格中的细胞。算出1 10-3ml的细胞数。（每个大方格的细胞数。（每个大方格1 10-4ml 10个个大方格大方格 10-3ml溶剂）细胞总数乘以溶剂）细胞总数乘以1000即即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。得每毫升计数细胞悬液的细胞数。v8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。玻片。用擦净纸擦干。v每毫升细胞总数每毫升细胞总数=v(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2)观察培养情况观察培养情况