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1、原代细胞培养实验原代细胞培养实验2010-2010-2011-22011-2v掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。v了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。v了解原代细胞培养的一般方法与步骤。了解原代细胞培养的一般方法与步骤。v了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。v了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。v了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。实验目的和要求：实验目的和要求：v2)将将12个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用用PBS漂洗。漂洗。v3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于
2、一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离的无菌离心筒中心筒中, 加入加入40ml 0.25的无菌胰蛋白酶的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻用搅拌棒轻轻搅动搅动 。v4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 C培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动15分分钟。钟。v5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照的离心管中，该管内按照每每10ml上清加入上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。胰蛋白酶。v6)6)加人新
3、鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液( (见前述步骤见前述步骤) )于含有残留未消化组于含有残留未消化组织块的原来的织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤4 4和和5 5。v7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r1200rrainrain，5 5分钟，弃上清。分钟，弃上清。v8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤7 7再次离心。再次离心。v9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。v10)10)用含有用含有1010牛血清和抗生素牛血清和抗生素( (如青霉素、链
4、霉素如青霉素、链霉素) )的的DMEM(GIBCODMEM(GIBCOBRL)lOmlBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为再悬沉淀，并使终体积为20ml20ml。v11)11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。v12)为确定现有细胞浓度，加入为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于细胞悬液于1.8ml 1醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞记数方法见传代培
5、养课件）（细胞记数方法见传代培养课件）v13)按每细胞瓶按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于细胞的数量接种于10ml组织培养液中，组织培养液中，在饱和湿度的在饱和湿度的37 C02培养箱中孵育直至细胞铺满。培养箱中孵育直至细胞铺满。v14）24小时后即可观察小时后即可观察 。 细胞记数细胞记数v1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。重悬于细胞培养液中。v2.用沾有用沾有70%酒精的棉球擦净细胞计数板和酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。v3.用移液器吸取细胞标本用移液器吸取细
6、胞标本10l，加入，加入10l台台盼氏兰溶液混匀，吸取盼氏兰溶液混匀，吸取10l混合液从盖玻片混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。v4.在显微镜下，计数或细胞。在显微镜下，计数或细胞。v5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（和中间的大方格中（5个格）的细胞数。个格）的细胞数。v6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。室计细胞数。v7.合计合计10个大方格中的细胞。算出个大方格中的细胞。算出1 10-3ml的细胞数。（每个大方格的细胞数。（每个大方格1 10-4ml 10个大个大方格方格 10-3ml溶剂）细胞总数乘以溶剂）细胞总数乘以1000即得即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。每毫升计数细胞悬液的细胞数。v8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。玻片。用擦净纸擦干。v每毫升细胞总数每毫升细胞总数 = v(A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2) 观察培养情况观察培养情况18 结束语结束语