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1、卫生微生物检测的基本技术第1页，本讲稿共24页一一、实验目的、实验目的1、掌握无菌操作、平板制备、接种、革兰氏染色及镜检、掌握无菌操作、平板制备、接种、革兰氏染色及镜检技术。技术。2、熟悉革兰氏染色的原理。、熟悉革兰氏染色的原理。3、了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。、了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。第2页，本讲稿共24页二、实验仪器与材料二、实验仪器与材料大肠杆菌、芽胞杆菌大肠杆菌、芽胞杆菌革兰氏染色液革兰氏染色液 载玻片载玻片显微镜等显微镜等第3页，本讲稿共24页三、实验内容三、实验内容第4页，本讲稿共24页1、无菌技术、无菌技术火焰周围火焰周围10厘米厘米第5页，本讲稿共2
2、4页液体培养基接种：液体培养基接种：接种环退出前，靠几下管壁，抖掉接种环上接种环退出前，靠几下管壁，抖掉接种环上的菌液。接种环从后往前烧。的菌液。接种环从后往前烧。半固体培养基：穿刺接种半固体培养基：穿刺接种 接种针接种针 中间垂直中间垂直 接近管底，但是不接近管底，但是不能刺穿能刺穿 0.5-1cm 0.2-0.7%2、接种、接种第6页，本讲稿共24页固体培养基：平板划线接种，斜面划线接种固体培养基：平板划线接种，斜面划线接种 从斜面底部向上划一条直线。，再从底部向上从斜面底部向上划一条直线。，再从底部向上Z形来回密集划形来回密集划线，不能划破。线，不能划破。第7页，本讲稿共24页染色标本制
3、备染色标本制备3、革兰氏染色、革兰氏染色第8页，本讲稿共24页 革兰氏染色法是革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家Christain Gran 创立的，基本步骤是：创立的，基本步骤是：1、初染：结晶紫染色、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染、媒染：碘液媒染 3、脱色：、脱色：95%乙醇脱色乙醇脱色 4、复染：番红复染、复染：番红复染第9页，本讲稿共24页实验原理：实验原理：细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成细胞壁的成分和结构分和结构不同而造成的。不同而造成的。初染后，初染后，所有所有细菌都被染成初染剂的细菌都被染成初染剂的蓝紫
4、色蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫碘的复碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。合物，增强染料与细菌的结合力。第10页，本讲稿共24页当用脱色剂处理时，当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌的细胞壁主要由的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫
5、色。脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含肽聚糖层较薄、类脂质含量高量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。染后，细胞被染上复染剂的红色。第11页，本讲稿共24页步骤步骤1：涂片：涂片 用接种环滴加1-2环环或滴一小滴生理盐水，挑取少量少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀均匀的薄层薄
6、层，菌膜直径在0.51cm。火烤，酒精棉球如果水多了，菌挑多了，接种环灭菌从后往前第12页，本讲稿共24页步骤步骤2：干燥：干燥 涂好的菌膜在室温下自然干燥。也可在酒精灯上方稍微加热（10cm），但不能紧靠火焰。步骤步骤3:固定固定手持载玻片的一端，菌膜面向上，在火焰最热部分迅速通过2-3次次，待玻片冷却冷却后方可染色。第13页，本讲稿共24页 结晶紫染色晶紫染色 1min 1min 水洗，用水洗，用滤纸吸干。吸干。刚好覆盖为宜 水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水水洗时，不要直接冲菌膜面，而应使水 从载玻片的一端流下，水流不宜
7、过从载玻片的一端流下，水流不宜过从载玻片的一端流下，水流不宜过从载玻片的一端流下，水流不宜过 急，以免涂片薄膜脱落。急，以免涂片薄膜脱落。急，以免涂片薄膜脱落。急，以免涂片薄膜脱落。步骤步骤4:染色染色第14页，本讲稿共24页碘液媒染碘液媒染 1min，水洗，水洗，滤纸吸干。滤纸吸干。95%酒精脱色酒精脱色 20-30s，水洗，水洗，滤滤纸吸干。纸吸干。滴加滴加：轻轻摇动，一般：轻轻摇动，一般30s流加：流出的乙醇无紫色。流加：流出的乙醇无紫色。第15页，本讲稿共24页番红复染番红复染 1-2min，水洗，滤，水洗，滤纸吸干。纸吸干。第16页，本讲稿共24页染色结果步骤步骤5:5:镜检镜检 干
8、燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准。干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准。第17页，本讲稿共24页滴加香柏油。滴加香柏油。转动转换器时，不要用手指扳动物镜镜头。转动转换器时，不要用手指扳动物镜镜头。从侧面注视，上升载物台，使油镜前端浸入香柏油中并几乎从侧面注视，上升载物台，使油镜前端浸入香柏油中并几乎与标本相接。与标本相接。旋动旋动粗粗调节器，使载物台徐徐下降，直至出现物象，再用调节器，使载物台徐徐下降，直至出现物象，再用细细调调节器调至物像清晰为止。（节器调至物像清晰为止。（反方向反方向）注意：方向注意：方向 如果油镜已经离开油面，则必须重新从侧面注视，再将油镜头浸入油中，重复上面操
9、作。如果油镜已经离开油面，则必须重新从侧面注视，再将油镜头浸入油中，重复上面操作。4、显微镜的使用、显微镜的使用第18页，本讲稿共24页用干净擦镜纸擦去镜头上的油滴，用干净擦镜纸擦去镜头上的油滴，用乙醚用乙醚-乙醇混合液润湿一新的擦镜纸，乙醇混合液润湿一新的擦镜纸，一个一个方向方向擦拭镜头擦拭镜头1-2次，次，来回（来回（）最后再用干净的擦镜纸擦去乙醚最后再用干净的擦镜纸擦去乙醚-乙醇混合乙醇混合液残渍。液残渍。将物镜镜头转成将物镜镜头转成“八八”字形。载物台降至最低。字形。载物台降至最低。显微镜的维护显微镜的维护第19页，本讲稿共24页制片的注意事项：制片的注意事项：1.载玻片要洁净无油迹。
10、载玻片要洁净无油迹。2.滴生理盐水不要过多。滴生理盐水不要过多。3.挑菌量宜少。挑菌量宜少。4.涂片要均匀，菌膜宜薄。涂片要均匀，菌膜宜薄。5.涂菌的动作要轻，防止菌液迸溅。涂菌的动作要轻，防止菌液迸溅。6.沾有细菌的接种环要及时火焰灭菌。沾有细菌的接种环要及时火焰灭菌。四、四、注意事项注意事项第20页，本讲稿共24页1.1.选用培养选用培养18-2418-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应2.2.水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端水洗时，不要直接冲洗涂面
11、，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。3.3.酒精脱色酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。革兰染色的注意事项革兰染色的注意事项第21页，本讲稿共24页显微镜使用中的注意事项显微镜使用中的注意事项1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.2.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托
12、镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。座，不可单手拿，更不可倾斜拿。3.3.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布。镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布。第22页，本讲稿共24页五、革兰染色结果报告：绘图：绘图：镜下颜色，形状，排列方式；镜下颜色，形状，排列方式；标注染色方法，放大倍数，标本号。标注染色方法，放大倍数，标本号。文字说明：文字说明：镜下可观察到：镜下可观察到：有染成紫色的革兰阳性菌，球菌，有染成紫色的革兰阳性菌，球菌，呈单个、成双、短链或葡萄串状排列；呈单个、成双、短链或葡萄串状排列；有染成紫色的革有染成紫色的革兰阳性菌，大杆菌，两端钝圆，芽胞位于菌体中心或次极兰阳性菌，大杆菌，两端钝圆，芽胞位于菌体中心或次极端，呈散在或链状排列；端，呈散在或链状排列；有染成红色的革兰阴性菌，短有染成红色的革兰阴性菌，短小杆菌，呈散在排列。小杆菌，呈散在排列。（双色笔）（双色笔）革兰氏染色，革兰氏染色，1000（目镜（目镜 物镜），物镜），01 第23页，本讲稿共24页革兰染色革兰染色试剂ABCD第24页，本讲稿共24页