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1、蛋白质分子中氨基酸序列的确定一、准备工作二、测序三、拼接及二硫键位置的确定一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、（1）确定多肽链的数目（2）拆分多肽链（3）分离纯化各条多肽链（4）确定各条多肽链的AA组成末端分析法打开二硫键电泳、层析水解AA分析仪水合茚三酮法Edman反应HPLCAA的比率或百分含量蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定二、测序（1）特异性的打断多肽链，产生适合测序大小的肽段（2）分离纯化肽段（3）确定每一肽段的AA顺序（4）采用另一种特异性试剂将多肽链打断，重复1-3一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序
2、列的确定三、拼接及二硫键位置的确定（1）利用重叠拼接法拼接各肽段，确定AA的顺序（2）确定多肽链内和链间的二硫键的位置对角线电泳法二、测序一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、（1）确定多肽链的数目（2）拆分多肽链（3）分离纯化各条多肽链（4）确定各条多肽链的AA组成末端分析法打开二硫键电泳、层析水解AA分析仪水合茚三酮法Edman反应HPLCAA的比率或百分含量蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链数目确定末端分析法(N端)化学法问题N端AA被封闭，不能与化学试剂反应焦谷氨
3、酰化，乙酰化，环状肽.焦谷氨酸氨肽酶N端为Gln时会环化成焦谷氨酰基蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链数目确定末端分析法(N端)蛋白质N末端测序中的3种方法：与丹磺酰氯(DNS-Cl)反应：生成荧光物质DNS-AA，灵敏度高与2,4-二硝基氟苯(2,4-DNFB)反应(Sanger反应)：生成黄色的二硝基苯-AA衍生物，利用乙醚抽提层析鉴定与苯异硫氰酸酯(PITC)反应(Edman反应)：生成PTH-AA，乙酸乙酯抽提层析鉴定蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定酶解法氨肽酶：肽链外切酶，从N端每次降解一个AA残基p随酶水解进程，将释放的AA分别定量
4、测出可测得肽的序列p最常用：亮氨酸氨肽酶（LAP），N端的第二个AA是Pro时不能将N端AA水解下来外，其余所有N端的肽键都能被LAP水解，但水解速度差异大：uN端为Leu最快；N端为非极性AA快；N端为其他AA慢p常用：氨肽酶Mp问题：酶的专一性肽链数目确定末端分析法(N端)蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定化 学 法p无水肼NH2NH2p条件：100 5-10hp苯甲醛沉淀AA的酰肼，C端游离AA留在上清中pGln,Asn,Cys,Arg不能用此法肽链数目确定末端分析法(C端)蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定羧肽酶法：从多肽链的C端逐个降解，释
5、放出游离的AAp羧肽酶A(牛胰)：水解除Pro、Arg和Lys之外所有的C端残基p羧肽酶B(猪胰)：只能水解以Arg和Lys为C端的肽键p羧肽酶C(柑橘叶)和羧肽酶Y(酵母)：作用于任何一个C端残基Pro以外的任意C端残基C端序列为-Thr-Val-Phe酶 解 法肽链数目确定末端分析法(C端)蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、（1）确定多肽链的数目（2）拆分多肽链（3）分离纯化各条多肽链（4）确定各条多肽链的AA组成末端分析法打开二硫键电泳、层析水解AA分析仪水合茚三酮法Edman反应HPLCAA的比率或百分含量蛋白质分子中氨基酸
6、序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链的分离，纯化与测定肽链之间的连接方式共价键：二硫键(多)、酰胺键、酯键非共价键：氢键、离子键、疏水作用、范德华力蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链的分离，纯化与测定肽链之间的连接方式共价键：二硫键(多)、酰胺键、酯键非共价键：氢键、离子键、疏水作用、范德华力蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定二硫键的断裂过甲酸氧化切割巯基化合物(2-巯基乙醇/二硫苏糖醇)还原切割碘乙酸反应保护游离的-SH产物稳定不稳定肽链的分离，纯化与测定肽链之间的连接方式共价键：二硫键(多)、酰胺键、酯键非共价键：氢键、离子键、疏水作用
7、、范德华力蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定二硫键的断裂过甲酸氧化切割巯基化合物(2-巯基乙醇/二硫苏糖醇)还原切割碘乙酸反应保护游离的-SH产物稳定不稳定非共价键的拆分p8mol/L尿素p6mol/L盐酸胍p高浓度盐多聚蛋白质中的亚基分开根据大小/电荷的不同分离各肽链(层析/电泳)通常：8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍+巯基乙醇一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、（1）确定多肽链的数目（2）拆分多肽链（3）分离纯化各条多肽链（4）确定各条多肽链的AA组成末端分析法打开二硫键电泳、层析水解AA分析仪水合茚三酮法Edman反应HPLCAA的比率或百分含量蛋白质分子中
8、氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定6mol/L HCI水解蛋白质氨基酸分析仪的离子交换柱分离水合茚三酮测含量Edman反应将AA转化为PTH-AAHPLC分离，同时进行定量分析Trp完全被沸酸所破坏；羟基AA有一部分被分解；Asn和Gln的酰胺基被水解下来;需用碱水解或酶水解另行测定不能直接给出多肽链中每种AA残基的数目，得出各种AA的比率或百分含量确定AA的组成蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定二、测序（1）特异性的打断多肽链，产生适合测序大小的肽段（2）分离纯化肽段（3）确定每一肽段的AA顺序（4）采用另一种特异性试剂将多肽链打断，重复1-3一、准备工作分离
9、纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接化学裂解法溴化氰(CNBr)专一裂解Met羧基形成的肽键Met的甲基被夺取高丝氨酸高丝氨酸蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接化学裂解法羟胺断裂裂解Asn-Gly形成的肽键蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定问题：识别位点相对CNBr要少专一性稍差，弱酸性条件下可水解Asn-Leu及Asn-Ala之间的
10、肽键肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接酶解法胰蛋白酶识别Lys和Arg羧基端的肽键蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定Lys和Arg都是碱性AA，R基末端带正电荷识别Lys和Arg的R基的结构可用化学修饰将多肽链侧链保护起来增加/减少作用位点肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接酶解法胰蛋白酶识别Lys和Arg羧基端的肽键蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定Lys和Arg都是碱性AA，R基末端带正电荷识别Lys和Arg的R基的结构可用化学修饰将多肽链侧
11、链保护起来增加/减少作用位点Lys和Arg较多1,2-环己二酮封闭Arg的胍基只作用于Lys减少作用位点马来酸封闭Lys只作用于Arg肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接酶解法胰蛋白酶识别Lys和Arg羧基端的肽键蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定Lys和Arg都是碱性AA，R基末端带正电荷识别Lys和Arg的R基的结构可用化学修饰将多肽链侧链保护起来增加/减少作用位点Lys和Arg较少氮丙啶修饰Cys使Cys侧链与Lys类似增加作用位点肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后
12、拼接酶解法胰蛋白酶识别Lys和Arg羧基端的肽键蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定Lys和Arg都是碱性AA，R基末端带正电荷识别Lys和Arg的R基的结构可用化学修饰将多肽链侧链保护起来增加/减少作用位点Lys和Arg较少氮丙啶修饰Cys使Cys侧链与Lys类似增加作用位点肽链的部分水解拆链得到的多肽链一般较大，需将其切割成小肽段，分别测定AA的序列，然后拼接酶解法糜蛋白酶蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定断裂Phe、Trp或Tyr的羧基形成的肽键受邻近基团的影响：碱性裂解能力；酸性裂解能力二、测序（1）特异性的打断多肽链，产生适合测序大小的肽段（
13、2）分离纯化肽段（3）确定每一肽段的AA顺序（4）采用另一种特异性试剂将多肽链打断，重复1-3一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定电泳法：SDS-PAGE离子交换层析法：EDAE-Cellulose、EDAE-Sepharose FF凝胶过滤法分子大小电荷分子大小肽段的分离和纯化蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定Edman法质谱法核苷酸序列推定法苯异硫氰酸酯苯乙内酰硫脲氨基酸肽段AA序列测定蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定p真核生物基因组含有内含子p蛋白翻译后的修饰p二硫键位置过程:耦合切
14、割萃取转化鉴定耦合：pH9.0，异硫氰酸苯酯(PITC)和多肽N端AA耦合苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物切割：三氟乙酸(TFA)处理耦合产物，将多肽N端第一个肽键选择性切断，释放出该AA残基的噻唑啉酮苯胺衍生物和少一个AA残基的肽链萃取：乙酸乙酯萃取出释放的AA衍生物转化：强酸条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-AA)鉴定：色谱法鉴定降解下来的PTH-AA种类，得到蛋白质或多肽N端序列信息优点:PITC与所有AA残基的反应产率和回收率都相当高，反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。质谱法p质谱法：磁场中运动的带电粒子因质量与携带电荷的比值(质荷比)不同，以不同的速度和偏转角度穿过磁场，按一
15、定的次序进入监测器，由此来判断粒子的质量和特性p串联质谱法(MS/MS)：分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按质荷比分离，依次经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的AA序列p优点：同时进行肽段的分离和序列分析，提高测序的效率，高通量研究p缺点：不能区分Leu和Ile肽段AA序列测定蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定二、测序（1）特异性的打断多肽链，产生适合测序大小的肽段（2）分离纯化肽段（3）确定每一肽段的AA顺序（4）采用另一种特异性试剂将多肽链打断，重复1-3一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨
16、基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定长肽链裂解分离后分别测序拼接基本方法：从一套肽段中选定一个肽段，再从另一套肽段中寻找与其有部分重叠的肽段，反复交替N段残基:HC端残基:S第一套肽段OUSPSEOVERLAHOWT第二套肽段SEOWTOUVERLAPSHO末端末端HS末端末端肽段段HOW TA P S或或O US第一套第一套肽段段HOWTP S第二套第二套肽段段WT O UA P S第一套第一套肽段段O U SRL A第二套第二套肽段段S E O V E RL第一套第一套肽段段E O V E第二套第二套肽段段HO全序列全序列HOWT O U S E O VERL A P S肽段拼接成肽
17、链重叠法蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定三、拼接及二硫键位置的确定（1）利用重叠拼接法拼接各肽段，确定AA的顺序（2）确定多肽链内和链间的二硫键的位置对角线电泳法二、测序一、准备工作分离纯化待测肽链(97%)、蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定对角线电泳水解蛋白质(胃蛋白酶)(不断裂二硫键)方形滤纸上对水解产物进行第一次电泳过甲酸处理滤纸(断裂二硫键)滤纸旋转90二次电泳(条件同第一次)含二硫键的肽段偏离对角线，将偏离对角线的肽段洗脱下来，测定序列，与完整肽链对比，找出二硫键的位置过甲酸处理时未发生变化的肽段处于对角线上二硫键位置的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子中氨基酸序列的确定