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1、2010年8月生物制药温州医学院温州医学院生命科学学院生命科学学院王慧利王慧利内容内容n n第一章第一章第一章第一章绪论绪论n n第二章第二章第二章第二章 生物药物概论生物药物概论生物药物概论生物药物概论 n n第三章第三章第三章第三章 生物制药工艺学生物制药工艺学生物制药工艺学生物制药工艺学n n第四章第四章第四章第四章 基因工程制药基因工程制药基因工程制药基因工程制药n n第五章第五章第五章第五章抗体工程制药抗体工程制药抗体工程制药抗体工程制药n n第六章第六章第六章第六章 动物细胞制药动物细胞制药动物细胞制药动物细胞制药 n n第七章第七章第七章第七章 植物细胞制药植物细胞制药植物细胞制
2、药植物细胞制药n n第八章第八章第八章第八章 酶工程制药酶工程制药酶工程制药酶工程制药 n n第九章第九章 海洋生物制药海洋生物制药海洋生物制药海洋生物制药 n n第十章第十章 利用现代生物技术改造传统制药工业利用现代生物技术改造传统制药工业第五章 抗体工程制药第一节第一节 概论：概论：1 1 抗体概念抗体概念 2 2 抗体产生细胞学基础抗体产生细胞学基础 3 3 抗体特性抗体特性 4 4 抗体结构及多样性抗体结构及多样性 5 5 抗体形成的研究历史抗体形成的研究历史第二节第二节 抗体工程抗体工程 1 1 多克隆抗体多克隆抗体 2 2 单克隆抗体单克隆抗体 3 3 基因工程抗体基因工程抗体 4
3、 4 抗体库抗体库 5 5 应用：应用：抗体诊断试剂的研究抗体诊断试剂的研究 抗体治疗药物的研究抗体治疗药物的研究（1 1 1 1）抗体基本概念）抗体基本概念）抗体基本概念）抗体基本概念第一节 概论抗体抗体机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白（Ig）。如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血症、冷球蛋白血症等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及“正常人”天然存在的免疫球蛋白亚单位等。l因而免疫球蛋白是结构及化学的概念，而抗体是生物学及功能的概念。l所有抗体都是免
4、疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗体。l免疫球蛋白免疫球蛋白具有免疫功能的血清组分，不一定具有抗体活性具有免疫功能的血清组分，不一定具有抗体活性要素：B 细胞 产生，免疫功能（与抗原结合）球蛋白免疫反应免疫反应（2 2）抗体的细胞学基础抗体的细胞学基础免疫：免疫：系指机体对感染有抵抗能力，而不患疾病或传染病。组织和器官免疫系统免疫系统 细胞 免疫学免疫学是研究免疫系统的结构与功能，理解其对机体有益的防卫功能和有害的病理作用及其机制，以发展有效的免疫学措施，实现防病、治病的目的。活性分子免疫分子（抗体，补体，细胞因子等）免疫分子（抗体，补体，细胞因子等）免疫分子（抗体，补体，细胞因子等）免疫分
5、子（抗体，补体，细胞因子等）免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞 ：(淋巴细胞、粒细胞淋巴细胞、粒细胞淋巴细胞、粒细胞淋巴细胞、粒细胞 及白细胞、浆细胞、肥大细胞及白细胞、浆细胞、肥大细胞及白细胞、浆细胞、肥大细胞及白细胞、浆细胞、肥大细胞等等等等)免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器免疫器官：中枢免疫器官和周围免疫器 官官官官 ；AAAA中枢器官是免疫细胞发生和分化的场中枢器官是免疫细胞发生和分化的场中枢器官是免疫细胞发生和分化的场中枢器官是免疫细胞发生和分化的场所所所所(胸腺胸腺胸腺胸腺-T-T-T-T、骨髓、骨髓、骨髓、骨髓成
6、血干细胞和鸟类成血干细胞和鸟类成血干细胞和鸟类成血干细胞和鸟类法氏囊法氏囊法氏囊法氏囊-B)-B)-B)-B)BBBB周围免疫器官是免疫细胞居住和发生周围免疫器官是免疫细胞居住和发生周围免疫器官是免疫细胞居住和发生周围免疫器官是免疫细胞居住和发生场所场所场所场所:淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组淋巴结、脾脏、黏膜相关的淋巴组织织织织-分布于呼吸道、消化道分布于呼吸道、消化道分布于呼吸道、消化道分布于呼吸道、消化道 泌尿系统泌尿系统泌尿系统泌尿系统黏膜黏膜黏膜黏膜1免疫系统免疫系统免疫系统与免疫细胞免疫系统与免疫细胞淋巴结网淋巴管左右锁骨
7、下静脉并入血液循环ThymusBone MarrowWaldeyer”s ring咽淋巴环咽淋巴环(lymph nodes,tonsils)扁桃腺 Bronchus-associatedLymphoid tissueLymph nodes（淋巴结）Spleen（脾）Lamina propria粘膜下层 MesentericLymph node肠系膜淋巴 结Peyer”s patchGenitourinalLymphoid tissueLymphnodes皮耶氏节 生殖器淋巴 组织胸腺骨髓免疫器官和组织的分布免疫器官和组织的分布免疫系统与免疫细胞免疫系统与免疫细胞2 2、免疫细胞：主要包括淋巴细
8、胞、粒细胞和肥大、免疫细胞：主要包括淋巴细胞、粒细胞和肥大细胞，单核巨噬细胞，树突状细胞。细胞，单核巨噬细胞，树突状细胞。免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞 按表面分子标志及功能分：按表面分子标志及功能分：按表面分子标志及功能分：按表面分子标志及功能分：T T T T细胞、细胞、细胞、细胞、B B B B细胞、非细胞、非细胞、非细胞、非T T T T非非非非B B B B 淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞 T T T T细胞细胞细胞细胞：据表面带有据表面带有据表面带有据表面带有CD4CD4CD4CD4或或或或CD8CD8CD8CD8分子分子分子分子分辅助性分辅助性分辅助性分辅助性T T T T细
9、胞、细胞、细胞、细胞、杀伤性杀伤性杀伤性杀伤性T T T T细胞、抑制性细胞、抑制性细胞、抑制性细胞、抑制性T T T T细胞，参与细胞，参与细胞，参与细胞，参与细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫。B B B B细胞：细胞：细胞：细胞：转化为浆细胞、产生抗体，参与转化为浆细胞、产生抗体，参与转化为浆细胞、产生抗体，参与转化为浆细胞、产生抗体，参与体液免疫体液免疫体液免疫体液免疫，B1B1B1B1和和和和B2B2B2B2。NKNKNKNK（natural killernatural killernatural killernatural killer）细胞细胞细胞细胞：无需无需无需无需辅助辅助辅助
10、辅助细胞细胞细胞细胞或分子的参与，或分子的参与，或分子的参与，或分子的参与，即可直接杀伤病变细胞即可直接杀伤病变细胞即可直接杀伤病变细胞即可直接杀伤病变细胞。释放。释放。释放。释放穿孔素和颗粒酶穿孔素和颗粒酶穿孔素和颗粒酶穿孔素和颗粒酶造成靶细胞死造成靶细胞死造成靶细胞死造成靶细胞死亡，也可通过肿瘤坏死因子杀伤靶细胞亡，也可通过肿瘤坏死因子杀伤靶细胞亡，也可通过肿瘤坏死因子杀伤靶细胞亡，也可通过肿瘤坏死因子杀伤靶细胞B B细胞细胞 骨髓骨髓干细胞干细胞 B B前体细胞在前体细胞在骨髓中成熟释放骨髓中成熟释放 成熟成熟B B细胞细胞 释放于淋巴系统释放于淋巴系统 激活激活B B细胞细胞 分化成浆
11、细分化成浆细胞，分泌胞，分泌抗体抗体抗体抗体或记忆或记忆B B细胞，细胞，形成免疫记忆形成免疫记忆T淋巴细胞 骨髓骨髓干细胞（干细胞（类囊器官类囊器官)T T前体细胞进入胸腺，前体细胞进入胸腺，成熟成熟T T细胞细胞 释放于淋巴系统释放于淋巴系统 激活激活T T细胞细胞 分化成分化成 杀伤杀伤T T细胞，细胞，辅助辅助T T细胞细胞 抑制抑制T T细胞细胞 记忆记忆T T细胞细胞杀伤细胞分泌细胞因子，辅助B细胞激活或杀伤细胞形成免疫记忆抑制过敏反应皮肤T cell 淋巴瘤患者T T T Tc c c c细细细细胞胞胞胞攻攻攻攻击击击击肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞扫扫扫扫描描描描电电电电镜镜
12、镜镜像像像像(体体体体外外外外培培培培养养养养实实实实验验验验 人人人人工工工工加加加加色色色色)细胞杀伤T淋巴细胞人T淋巴细胞攻击母细胞瘤细胞T T辅助细胞介导辅助细胞介导B B细细胞的激活胞的激活巨噬细胞的吞噬作用巨噬细胞的吞噬作用其它免疫细胞中性粒细胞、血小板等n3 3、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和体液免、免疫因子：主要包括膜表面免疫因子和体液免疫因子。疫因子。nB B和和T T细胞表面有各自的特异性膜表面抗原受体细胞表面有各自的特异性膜表面抗原受体BCRBCR和和TCR,TCR,能识别特异性抗原并与之结合，启动特异能识别特异性抗原并与之结合，启动特异性免疫。性免疫。n体液免疫因子
13、主要包括抗体、补体和细胞因子。体液免疫因子主要包括抗体、补体和细胞因子。细胞因子是细胞因子是免疫细胞分泌的低分子的多肽免疫细胞分泌的低分子的多肽，包括，包括白细胞介素（白细胞介素（ILIL）集落刺激因子（）集落刺激因子（CSFCSF）干扰素）干扰素（INFINF）肿瘤坏死因子）肿瘤坏死因子(TNF)(TNF)及转化生长因子及转化生长因子(TGF),(TGF),具有多方面调节作用；既有具有多方面调节作用；既有细胞毒素和抗细胞毒素和抗病毒病毒功能，直接参与免疫应答的效应过程功能，直接参与免疫应答的效应过程（3）抗体的特性（1 1 1 1）结合特异性抗原：）结合特异性抗原：）结合特异性抗原：）结合特
14、异性抗原：抗体与其它免疫球蛋白分子最大区别就在于抗体抗体与其它免疫球蛋白分子最大区别就在于抗体能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应；抗体是靠其能与相应抗原发生特异性结合，在体内导致生理或病理效应；抗体是靠其分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。分子上的特殊的结合部位与抗原结合的。（2 2 2 2）激活补体：）激活补体：）激活补体：）激活补体：抗体与相应抗原结合后，借助暴露的补体结合点去激活抗体与相应抗原结合后，借助暴露的补体结合点去激活补补体体系统、激发补体的系统、激发补体的溶菌、溶细胞溶菌、溶细胞等免疫作用。等免疫作用。（3 3 3 3）结合细胞：）结合细胞：）结合细胞：）结合
15、细胞：不同类别的免疫应答不同类别的免疫应答。（4 4 4 4）可通过胎盘及粘膜：）可通过胎盘及粘膜：）可通过胎盘及粘膜：）可通过胎盘及粘膜：免疫球蛋白免疫球蛋白G G（IgGIgG）能通过胎盘进入胎儿血流）能通过胎盘进入胎儿血流中，使胎儿形成中，使胎儿形成自然被动免疫自然被动免疫。免疫球蛋白。免疫球蛋白A A（IgAIgA）可通过消化道及呼吸）可通过消化道及呼吸道粘膜，是粘膜道粘膜，是粘膜局部抗感染免疫局部抗感染免疫的主要因素。的主要因素。（5 5 5 5）具有抗原性：）具有抗原性：）具有抗原性：）具有抗原性：抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产生免疫应抗体分子是一种蛋白质，也具有刺激机体产
16、生免疫应答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。答的性能。不同的免疫球蛋白分子，各具有不同的抗原性。（6 6 6 6）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同）抗体对理化因子的抵抗力与一般球蛋白相同：不耐热，不耐热，60607070即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作即被破坏。各种酶及能使蛋白质凝固变性的物质，均能破坏抗体的作用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清用。抗体可被中性盐类沉淀。在生产上常可用硫酸铵或硫酸钠从免疫血清中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经
17、透析法将其纯化。中沉淀出含有抗体的球蛋白，再经透析法将其纯化。生物学活性抗体结合抗原的活性抗体结合抗原的活性由B细胞产生的各种特异抗体与侵入机体的病毒或外毒素分子结合，从而阻断了病毒进入细胞的能力或中和了外毒素分子的毒性作用。抗体产生的规律（1 1）初次反应产生抗体）初次反应产生抗体：当抗原第一次进入机体时，需经：当抗原第一次进入机体时，需经一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在一定的潜伏期才能产生抗体，且抗体产生的量也不多，在体内维持的时间也较短。体内维持的时间也较短。（2 2）再次反应产生抗体）再次反应产生抗体：当相同抗原第二次进入机体后，：当相同抗原第二次进入机体后，开始时，
18、由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，开始时，由于原有抗体中的一部分与再次进入的抗原结合，可使原有抗体量略为降低。随后，可使原有抗体量略为降低。随后，抗体效价迅速大量增加，抗体效价迅速大量增加，可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间可比初次反应产生的多几倍到几十倍，在体内留存的时间亦较长。亦较长。（3 3）回忆反应产生抗体：）回忆反应产生抗体：由抗原刺激机体产生的抗体，经由抗原刺激机体产生的抗体，经过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已过一定时间后可逐渐消失。此时若再次接触抗原，可使已消失的抗体快速上升。若再次刺激机体的抗原与初次相同，消失的抗体快速上升。若再次刺
19、激机体的抗原与初次相同，则称为则称为特异性回忆反应特异性回忆反应；若与初次反应不同，则称为；若与初次反应不同，则称为非特非特异性回忆反应异性回忆反应。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂。非特异性回忆反应引起的抗体的上升是暂时性的，短时间内即很快下降。时性的，短时间内即很快下降。（4）抗体的基本结构和多样性）抗体的基本结构和多样性基因多样性决定抗体多样性基因多样性决定抗体多样性免疫球蛋白反应的特异性和分子的多样性是受基因支配；免疫球蛋白反应的特异性和分子的多样性是受基因支配；一条肽链的一条肽链的C C区和区和V V区分别由区分别由C C基因和基因和V V基因编码。任何一个基因编码。任何一个B
20、B细胞都有细胞都有3 3个独立的个独立的IgIg基因簇：基因簇：1 1个个H H链基因簇：链基因簇：2 2个个L L链基因簇：链基因簇：和和 共同构成共同构成IgIg的结构基因的结构基因在在B B细胞分化成熟过程中进行细胞分化成熟过程中进行基因重排，进而转录与翻译，进而转录与翻译，形成抗体。形成抗体。LH(5）抗体的分类（1 1 1 1）按作用对象）按作用对象）按作用对象）按作用对象，可将其分为可将其分为抗毒素抗毒素、抗菌抗菌抗体、抗体、抗病素抗病素抗抗体和体和亲细胞亲细胞抗体（能与细胞结合的免疫球蛋白，如抗体（能与细胞结合的免疫球蛋白，如1 1型变态型变态反应中的反应中的lgElgE反应素抗
21、体，能吸附在靶细胞膜上）。反应素抗体，能吸附在靶细胞膜上）。（2 2 2 2）按理化性质和生物学功能，）按理化性质和生物学功能，）按理化性质和生物学功能，）按理化性质和生物学功能，可将其分为可将其分为IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、IgEIgE、IgDIgD五类。五类。抗体的分类抗体的分类5 5大类：大类：IgGIgGIgGIgG-是成人血清中的主要成分是成人血清中的主要成分(75%),(75%),新生儿具有的新生儿具有的唯一一种抗体。唯一一种抗体。IgAIgAIgAIgA-在血清中只有在血清中只有15%,15%,但从整个人体中是量最大的抗体但从整个人体中是量最大的抗体（66mg/k
22、g/day66mg/kg/day），），4 46 6个月的婴儿就可以开始合成这种个月的婴儿就可以开始合成这种抗体。抗体。IgM-IgM-IgM-IgM-在血清中只有在血清中只有10%,10%,是最原始的也是最大一类（是最原始的也是最大一类（b b（5 5聚体聚体),),免疫系统启动时最早出现的抗体，也是免疫系统启动时最早出现的抗体，也是B B细胞细胞上的受体上的受体IgD-IgD-IgD-IgD-20-30ug/ml,3d,20-30ug/ml,3d,是是B B细胞上的主要受体细胞上的主要受体IgE-IgE-IgE-IgE-0.1-0.4ug/ml,3d,0.1-0.4ug/ml,3d,是引起
23、超敏反应的主要原因。是引起超敏反应的主要原因。hypersensitivity(allergichypersensitivity(allergic过敏过敏)Immunoglobulins-IgImmunoglobulins-Ig(glycoprotein(glycoprotein按理化性质和生物学功能按理化性质和生物学功能按理化性质和生物学功能按理化性质和生物学功能(5）抗体的分类（3 3）按与抗原结合后是否出现可见反应）按与抗原结合后是否出现可见反应，可将其分为：在介质参与下出现可见结合反应的完全抗体，即通常所说的抗体。不出现可见反应，但能阻抑抗原与其相应的完全抗体结合的不完全抗体。（4 4
24、）按抗体的来源，）按抗体的来源，可将其分为天然抗体和免疫抗体。抗体体内生成的理论抗体体内生成的理论n n 抗原刺激前，机体具有抗体初级库抗原刺激前，机体具有抗体初级库n n抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发抗原刺激后，抗体生成的细胞群体被选择，并发生克隆性增殖。生克隆性增殖。n n在抗原的反复刺激下，抗体的在抗原的反复刺激下，抗体的V V区发生高频率突区发生高频率突变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行变，产生高亲和力抗体的细胞被选择，抗体进行类别转换，最终抗体成熟。类别转换，最终抗体成熟。类别转换类别转换(仅在仅在C C区发生区发生DNADNA水平上的改变，导致抗体的类水平上的改
25、变，导致抗体的类别发生改变，别发生改变，C C区决定五种基区决定五种基本类别，本类别，第二节第二节 抗体工程研究抗体工程研究大致可分为大致可分为3 3个阶段个阶段：多克隆抗体阶段：多克隆抗体阶段：以以18901890年年发现白喉抗毒素为代表（Bering等），其特点特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体多克隆抗体。单克隆抗体阶段：单克隆抗体阶段：以以19751975年年 创建杂交瘤技术制备杂交瘤技术制备单克隆抗体单克隆抗体为代表（Milstein和khler ）。基基因因工工程程抗抗体体阶阶段段：以以19841984年年以基因工程方法制备抗体为代表，制造基因工程抗体（基因工程抗体（Morriso
26、n)Morrison)19891989年年WinterWinter等等首首次次构构建建了了抗抗体体基基因因库库，从从而而使使抗抗体体的的研研究究从从细细胞胞水水平平进进入入到分子水平，并推动了第到分子水平，并推动了第3 3代抗体代抗体基因工程抗体技术的发展基因工程抗体技术的发展。抗体工程抗体工程抗体工程抗体工程-是指利用单克隆抗体技术和基因工程技术进行天然抗体的生产和抗体的改造，以用于治疗难治疗疾病。如恶性肿瘤、病毒性感染、传染性疾病、风湿性关节炎，自身免疫系统疾病等，另外新型研制的抗体往往可作为诊断试剂。抗体工程抗体工程流程包括流程包括一、免疫动物的选择：选择动物时应考虑如下因素：一、免疫动
27、物的选择：选择动物时应考虑如下因素：1.1.抗原与免疫动物种属差异越远越好。抗原与免疫动物种属差异越远越好。2.2.动物必须适龄、健壮、无感染。动物必须适龄、健壮、无感染。3.3.动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该抗原对该动物免疫原性极差，则该动物不能选用。抗原对该动物免疫原性极差，则该动物不能选用。例如：例如：IgEIgE 绵羊，胰岛素绵羊，胰岛素-家兔，酶类家兔，酶类-山羊等。山羊等。（1）多克隆抗体免疫动物获得抗血清的途径一直是获得抗体的经典传统方法传统方法由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些由多种抗原决定
28、簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生体产生IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA、IgEIgE和和IgDIgD等五类抗体。等五类抗体。二、免疫方法二、免疫方法1.1.免疫的剂量免疫的剂量：应考虑抗原性的强弱、分子量的大小、：应考虑抗原性的强弱、分子量的大小、动物的状态和免疫时间。一般大动物的状态和免疫时间。一般大:0.5
29、:0.51mg/1mg/只，小只，小:0.1:0.10.6mg/0.6mg/只。只。2.2.免疫途径免疫途径：皮内或皮下免疫采用多点注射皮内或皮下免疫采用多点注射(810(810点点)。皮内注射。皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难射较困难(因佐剂加入后粘度大因佐剂加入后粘度大)；半抗原宜皮内多；半抗原宜皮内多点注射。点注射。用明矾作佐剂时，一般用于用明矾作佐剂时，一般用于肌肉注射肌肉注射(因皮下注射因皮下注射易引起肉芽肿和脓肿易引起肉芽肿和脓肿)；腹腔和静脉腹腔和静脉注射多用于颗粒性抗原和加强免疫。注射多用于颗粒性抗原和加强
30、免疫。对宝贵抗原对宝贵抗原，可采，可采用淋巴结内直接注射用淋巴结内直接注射抗原。抗原。3.3.免疫时间：免疫时间：首次和二次免疫之间要间隔约首次和二次免疫之间要间隔约20 20 天，二次以后每次间隔天，二次以后每次间隔710710天天。第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，极易造成极易造成免疫耐受免疫耐受。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。弱，造成抗体效价不高。三、动物采血法：三、动物采血法：1.1.颈动脉采血法颈动脉采血法 2.2.心脏采血法（常用于小动物）心脏
31、采血法（常用于小动物）3.3.静脉多次采血法静脉多次采血法四四 抗血清的纯化、鉴定和保存抗血清的纯化、鉴定和保存1.1.抗血清的纯化抗血清的纯化:亲和层析、吸附法纯化特异性抗体。亲和层析、吸附法纯化特异性抗体。用用40%40%、35%35%、33%33%的硫酸铵盐析三次的硫酸铵盐析三次(或或20%20%的硫的硫酸钠酸钠)粗提粗提-球蛋白，但仍含球蛋白，但仍含5%5%的其它蛋白。的其它蛋白。经离子层析、亲和层析纯经离子层析、亲和层析纯化化IgIg或酶解法制备或酶解法制备FabFab或或FcFc片段。片段。2.2.抗血清的鉴定抗血清的鉴定：双扩（特异性、效价）：双扩（特异性、效价）电泳（纯度）。电
32、泳（纯度）。3.3.抗血清的保存：过滤除菌后抗血清的保存：过滤除菌后。A 4A 4液态保存液态保存36m.36m.B 20-40 B 20-40 保存保存2323年，但避免反复冻融。年，但避免反复冻融。C C 冰冻干燥，冰冻干燥，4545年。年。多克隆抗体缺点多克隆抗体缺点1 纯度低：用来免疫动物的抗原可能含有多种抗原决定簇，因而进入机体后会产生多种抗体2 获得的抗体是非人源抗体2 单克隆抗体技术一、单克隆抗体一、单克隆抗体-(monoclonal-(monoclonal antibody,McAbantibody,McAb)单克单克隆是指由一个细胞经无性繁殖而形成的遗传性状完隆是指由一个细胞
33、经无性繁殖而形成的遗传性状完全相同的细胞群。一个全相同的细胞群。一个B B细胞杂交瘤细胞杂交瘤产生的只识别一产生的只识别一种抗原决定簇的抗体分子。种抗原决定簇的抗体分子。二、二、杂交瘤技术杂交瘤技术-用人工方法使抗体产生细胞与骨用人工方法使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞的一种技术。即将含有髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞的一种技术。即将含有特特异免疫信息的淋巴细胞异免疫信息的淋巴细胞与与具有无限增殖能力的肿具有无限增殖能力的肿瘤细胞瘤细胞，在诱导物（，在诱导物（PEGPEG）的作用下，使其融合产生）的作用下，使其融合产生一个新的具有特异活性细胞及其产物的技术。一个新的具有特异活性细胞及其产物
34、的技术。杂交瘤技术的原理：杂交瘤技术的原理：动物细胞的融合技术动物细胞的融合技术 利用聚乙二醇利用聚乙二醇(PEG)(PEG)作为细胞融合剂，使免疫的作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细小鼠脾细胞胞(能分泌某种抗体的能分泌某种抗体的B B细胞细胞)与具有在体外不断繁殖能力与具有在体外不断繁殖能力的的小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在融为一体，在HATHAT培养基的选择作用下，培养基的选择作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的单个细胞培只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的单个细胞培养养(克隆化克隆化)，最终获得既能产生所需抗体、又能不断繁殖最终获得既能产生所需抗体、又能不断繁殖的
35、杂交瘤的杂交瘤细胞纯系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹细胞纯系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆抗体。腔，在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆抗体。n n亲本细胞：亲本细胞：n n免疫小鼠的脾细胞（免疫小鼠的脾细胞（B B细胞）提供抗体细胞）提供抗体n n同系列小鼠的骨髓瘤细胞同系列小鼠的骨髓瘤细胞 提供单克隆繁殖体系提供单克隆繁殖体系HATHAT培养基是在常用的细胞培养基内添加了培养基是在常用的细胞培养基内添加了3 3种特殊成分：次黄种特殊成分：次黄嘌呤嘌呤(H)(H)、氨基蝶呤氨基蝶呤(A)(A)、胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)。1 1.脾细胞脾细胞
36、脾细胞脾细胞：在体外：在体外5757天内死亡，所以在天内死亡，所以在HATHAT培养基中培养基中最终死亡最终死亡。2.2.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：一般细胞合成：一般细胞合成DNADNA有两条途径：一条是主要途有两条途径：一条是主要途径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNADNA，此途径可此途径可被被氨基蝶呤氨基蝶呤(A)(A)所阻止。所阻止。另一条是替代途径：在次黄嘌呤另一条是替代途径：在次黄嘌呤(H)(H)和胸腺嘧啶和胸腺嘧啶(T)(T)存在下，存在下，由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)(HG
37、PRT)和胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷激酶激酶(TK)(TK)同时催化合成同时催化合成DNADNA 小鼠骨髓瘤细胞为小鼠骨髓瘤细胞为HGPRTHGPRT缺乏的缺陷型细胞缺乏的缺陷型细胞，在，在HATHAT中，正常中，正常合成合成DNADNA的途径被氨基蝶呤的途径被氨基蝶呤(A)(A)阻断，又因阻断，又因HGPRTHGPRT缺乏而不能缺乏而不能用替代途径，用替代途径，最终只能死亡最终只能死亡最终只能死亡最终只能死亡。3.3.杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞：合成：合成DNADNA的途径阻断，但可利用原脾细胞的的途径阻断，但可利用原脾细胞的HGPRTHGPRT完成替代途径的作用，完成替代途径
38、的作用，存活存活。筛选杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的HATHAT培养基：培养基：HAT选择培养基选择杂交瘤细胞原理示意图选择培养基选择杂交瘤细胞原理示意图HATHAT培养基是在常用的细胞培养基是在常用的细胞培养基内添加了培养基内添加了3 3种特殊成分：种特殊成分：次黄嘌呤次黄嘌呤(H)(H)、氨基蝶呤、氨基蝶呤(A)(A)、胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)。肿瘤细胞缺少HGRRT脾细胞：在体外57天内死亡只有杂交瘤细胞在这种条件下只有杂交瘤细胞在这种条件下可以永久存活可以永久存活单克隆抗体单克隆抗体McAbMcAb特点特点1 1、McAbMcAb以其纯度高、单一特异性，与一个抗原决定以其纯度高、单一
39、特异性，与一个抗原决定簇反应簇反应2 2、可重复性，能提供完全一样的抗体制剂、可重复性，能提供完全一样的抗体制剂3 3、一经制出可大量的供应；、一经制出可大量的供应；4 4、生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；、生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；5 5、灵敏性高等优点，能查出混合物中存在的用常规、灵敏性高等优点，能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。逐步取代了多克隆抗体方法查不出的少量成分。逐步取代了多克隆抗体试剂，减少了血清学上的试剂，减少了血清学上的交叉反应交叉反应，提高血清学，提高血清学实验诊断特异性和敏感性，实验诊断特异性和敏感性，McAbMcAb高度的生化均一高度的生化均
40、一性和生物活性单一性。性和生物活性单一性。n n主要临床应用1 1 病原微生物抗原的检测。病原微生物抗原的检测。2 2 肿瘤抗原的检测。肿瘤抗原的检测。3 3 免疫细胞免疫细胞 及其亚群的检测。及其亚群的检测。4 4 激素测定。激素测定。5 5 细胞因子的测定。细胞因子的测定。目前在美国单克隆抗体类药物已占目前在美国单克隆抗体类药物已占FDAFDA所批生物药的所批生物药的3/43/4。美国已上市美国已上市16种单克隆抗体药物种单克隆抗体药物 2002年销售额年销售额 29亿美元亿美元 2005年年 90亿美元亿美元 我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段用
41、作药物：用作药物：1 1 单克隆抗体具有导向治疗作用单克隆抗体具有导向治疗作用n nMcAb具有高度的特异性，能准确识别靶器官上的特异性抗原决定簇。将治疗药物等细胞毒素制剂与肿瘤抗原McAb相结合，利用McAb的导向作用，将药物或毒素携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为“免疫导弹”。药物分子McAb靶细胞，如肿瘤存在问题存在问题以单克隆抗体作为载体以单克隆抗体作为载体的药物可对肿瘤进行定向治疗。定向治疗。其障碍有：n 单克隆抗体均是鼠源性抗体鼠源性抗体，应用于人体内可产生人人抗鼠抗体（抗鼠抗体（HAMAHAMA），加速了排斥反应加速了排斥反应，在人体内的半衰期半衰期只有5 56 6小时小时，难以
42、维持有效药物作用靶组织时间。维持有效药物作用靶组织时间。n 完整的抗体分子（即Ig）的相对分子质量过大分子质量过大，难以穿难以穿透实体肿瘤组织透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度n改造：n降低单克隆抗体的免疫原性降低单克隆抗体的免疫原性；n降低单克隆抗体的相对分子质量降低单克隆抗体的相对分子质量基因工程抗体基因工程抗体3 基因工程抗体概念：利用基因工程技术，将特定的抗体的编码基因克隆到适当载体上，转移到合适表达细胞中，进行大量表达，从而获得的抗体称为基因工程抗体基因工程抗体主要分两大类，即基因工程抗体主要分两大类，即大分子抗体大分子抗体大分子抗体大分子抗体和和和和小分子抗体小分子抗体小分子抗体
43、小分子抗体。前。前者目的是使鼠单抗人源化（含有部分来自于人的抗体基因）；者目的是使鼠单抗人源化（含有部分来自于人的抗体基因）；而后者则是使抗体具有更好的通透性，易于到达靶部位。而后者则是使抗体具有更好的通透性，易于到达靶部位。V区C区人的IG鼠的IG嵌和体导入表达细胞大量表达产物提取和分析骨髓瘤细胞中80年代，开始研究抗体生产的人源化嵌合抗体.用人抗体的C区替代鼠抗体的C区，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。属第一代人源化抗体（HAb）1 1、获取目的基因、获取目的基因 一般都是提取杂交瘤细胞系的mRNA经反转录PCR（RTPCR）获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（V V
44、H H和和V VL L）基因。2 2、与合适载体连接在一起、与合适载体连接在一起 根据将要表达的细胞来选择合适的表达载体，这些载体必须高效表达，对细胞本身无害，又带有选择标记。3 3、基因工程抗体的表达、基因工程抗体的表达 导入表达细胞，筛选阳性克隆后，按其目的不同，可选用原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物原核细胞、真核细胞、转基因植物和动物等不同表达方式进行表达。基因工程抗体技术的步骤基因工程抗体技术的步骤A A、原核细胞表达、原核细胞表达 融合表达抗体末端附加一段其它肽段（如膜蛋白），作为标签，有利于对抗体文库进行淘淘筛筛，且有利于对克隆和抗体活性进行鉴定。（产物定位于细胞膜上）分泌型表
45、达利用琥琥珀珀终终止止密密码码（TGATGA）的的终终止止作作用用，在无琥珀抑制基因的菌株中进行表达，形成可溶性抗体。B B 真核细胞表达真核细胞表达 用于表达基因工程抗体的真核细胞有酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞和真菌等，而且这些细胞的表达都是分泌型表达。真核细胞表达抗体的方式在病毒病的防治和基因治疗上有重要价值。C C 转基因植物表达转基因植物表达 即将人的Ig基因组转移到植物体内，让植物产生人源化抗体D D 转基因动物表达转基因动物表达 即将人的Ig基因组转移到动物体内，让动物产生人源化抗体。4 4 抗体库技术抗体库技术1，1989年英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lern
46、er小组采用PCR克隆到全部抗体基因或将Ig的重链和轻链的基因片段随机配对克隆入适当的人工载体，并重组于原核表达细胞中。以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时成为组合抗体库技术抗体库技术抗体库技术是抗体工程研究领域的一次新飞跃。之是抗体工程研究领域的一次新飞跃。之前，基因工程抗体技术只能对已有的单抗进行改前，基因工程抗体技术只能对已有的单抗进行改造，而造，而抗体库技术的诞生抗体库技术的诞生却可以不通过却可以不通过动物免疫动物免疫和和细胞融合细胞融合便可以从抗体库中筛选得到全新的人便可以从抗体库中筛选得到全新的人源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生源化的抗体，并通过细菌发酵或转基因动植物生产出
47、来。产出来。抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全抗体库技术的发展使得抗体工程技术进入了一个全新的时期。新的时期。噬菌体抗体-90年代初，抗体基因与单链噬菌体的外壳蛋白融合并表达于噬菌体表面噬菌体表面，以固相化的抗原吸附相对应的噬菌体抗体，经过多次吸附洗脱扩增，即可得到所需要抗体，称噬菌体抗体。5 5、噬菌体抗体库技术将抗体全套可变区基因组装到噬菌体载体,并表达于噬菌体表面,所得到的多样性噬菌体抗体的集合，称为噬菌体抗体库。利用噬菌体抗体库，筛选并富集特异性抗体的过程，称为噬菌体抗体库技术。噬菌体抗体库技术的特点n n基因型和表型相统一 n n选择能力和扩增能力相结合噬菌体抗体库的构建筛
48、选流程筛选流程+噬菌体抗体库抗原再循环放大结合与洗涤洗脱二、二、噬菌体抗体库技术的特点噬菌体抗体库技术的特点基因工程抗体的延伸基因工程抗体的延伸1 1、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过超过10101111库容库容，建库的外源基因来自人体外周血、骨髓、骨髓细胞或脾脏的淋巴细胞提取的mRNAmRNA反转录形成的反转录形成的cDNAcDNA扩增扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNAmRNA。使用的通用引物通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的V VH H和和V VL L基因的随机重组也增加了抗体的多样性。能模拟天然全套抗体库。2 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术、
49、避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库抗体库的大容量和极高的筛选效率筛选效率，使得可以调出任意抗体基因调出任意抗体基因。因而能免除了人工免疫动物（多克隆抗体)和细胞融合技术（单克隆抗体)。3 3、可获得高亲和力的人源化抗体、可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗体库技术中V VH H和和V VL L基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的都是高亲和力的人源化抗体。人源化抗体。n n基因工程抗体及抗体库的优点：基因工程抗体及抗体库的优点：（1 1）通过基因工程技术改造，可以降低抗体的免疫原性，）通过基因工程技术改造，可以降低抗
50、体的免疫原性，使使抗体人源化抗体人源化抗体人源化抗体人源化，消除排斥（，消除排斥（HAMAHAMA）反应；）反应；（2 2）基因工程抗体的）基因工程抗体的分子质量较小分子质量较小分子质量较小分子质量较小，更利于穿透血管壁，更利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位，从而改善其体内药代动力学性质；进入病灶的核心部位，从而改善其体内药代动力学性质；（3 3）利用）利用抗体库抗体库抗体库抗体库技术技术，不需用抗原免疫动物便可以获得针，不需用抗原免疫动物便可以获得针对任何一种抗原决定簇的抗体，甚至制备出用单克隆抗体对任何一种抗原决定簇的抗体，甚至制备出用单克隆抗体技术无法实现的新型抗体：技术无法实现的新型抗