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1、生物制药课件(第五章)第一节第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法多肽及蛋白质类药物的生产方法一、蛋白质类药物的分离与纯化一、蛋白质类药物的分离与纯化（一）材料选择（一）材料选择原料来源原料来源:动、植物组织和微生物动、植物组织和微生物选择原则选择原则:富含所需蛋白质多肽成分富含所需蛋白质多肽成分易得易得易提取易提取无害无害基因工程菌（或细胞）、基因工程菌（或细胞）、转基因动、植物转基因动、植物影影响响天天然然蛋蛋白白质质类类药药物物质质量量、产产量量和和生生产产成成本本的的因素：因素：牛胰牛胰猪胰猪胰含量（含量（IU/Kg胰胰脏脏）40003000抗原性高抗原性高低低与人胰与人胰岛岛素差异素差
2、异3个个Aa1个个Aa（2）发育生长阶段）发育生长阶段（1）种属）种属 胸腺原料必须胸腺原料必须采自幼龄动物采自幼龄动物一般从胎儿、胎一般从胎儿、胎猪或胎牛肝中获猪或胎牛肝中获得得（3）生物状态）生物状态（4）原料来源）原料来源（5）原料解剖学部位）原料解剖学部位（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求胃粘膜总提取物、胃粘膜总提取物、胃蛋白酶、凝乳胃蛋白酶、凝乳酶、粘多糖酶、粘多糖（二）蛋白质提纯的一般方法（二）蛋白质提纯的一般方法分离依据：分离依据：分子量大小分子量大小溶解度溶解度电荷电荷吸附性质吸附性质对其他分子的生物亲和力对其他分子的生物亲和力等电点的概念
3、等电点的概念在在一一定定pH环环境境中中，某某一一种种蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，或或解解离离成成两两性性离离子子，其其净净电电荷荷为为零零，此时环境的此时环境的pH值即为该值即为该蛋白质的等电点蛋白质的等电点R CH COO-NH3+R CHCOO-NH2R CH COOH NH3+酸性碱性1、根据蛋白质、根据蛋白质等电点的不同等电点的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质 等电点时蛋白质的特性等电点时蛋白质的特性性性质质比比较较稳稳定定，物物理理性性质质如如导导电电性性、溶溶解解度度、粘粘度度、渗透压等均最小渗透压等均最小等电点的偏移等电点的偏移两两性性物物质质的
4、的等等电电点点会会因因条条件件不不同同（不不同同离离子子强强度度、有有机溶剂）机溶剂）而改变。而改变。当盐存在时，当盐存在时，pr若结若结合较多阳离子子，则合较多阳离子子，则PI向较高的向较高的pH偏移；偏移；反之，反之，PI移向较低移向较低pH根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质的根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质的方法方法：等电点沉淀法等电点沉淀法用用等等电电点点法法沉沉淀淀蛋蛋白白质质常常需需配配合合盐盐析析操操作作，而而除除去去不不需要的杂蛋白时，常需配合需要的杂蛋白时，常需配合热变性热变性操作。操作。等电聚焦电泳等电聚焦电泳a.分离蛋白质分离蛋白质b.测定蛋白质的等电点测定蛋白质的等电
5、点2、根据蛋白质、根据蛋白质分子形状和大小的不同分子形状和大小的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质蛋蛋白白质质是是生生物物大大分分子子,不不同同种种类类蛋蛋白白质质分分子子量量大大小小不不同同.方法方法：凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法适适用用范范围围：蛋蛋白白质质与与其其他他小小分分子子物物质质分分离离，以以及及大小不同的蛋白质分离。大小不同的蛋白质分离。注注意意用用超超滤滤法法时时，超超滤滤膜膜截截留留分分子子量量常常与与实实际际情情况况不不一一致致。分分子子量量相相近近的的蛋蛋白白质质由由于于在在介介质质中中有有呈呈线线形形溶溶质质或或者者是是球球形形溶溶质
6、质的的区区别别，可可能出现不同的结果。（能出现不同的结果。（分子形状分子形状）凝凝胶胶过过滤滤（体体积积排排阻阻色色谱谱）3、根据蛋白质、根据蛋白质溶解度的不同溶解度的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质蛋白质溶解度的影响因素蛋白质溶解度的影响因素溶液的溶液的pH离子强度离子强度溶剂的电解质性质溶剂的电解质性质温度温度根据蛋白质根据蛋白质溶解度的不同溶解度的不同来纯化蛋白质的方法：来纯化蛋白质的方法：a,盐溶与盐析法盐溶与盐析法硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀b,结晶法结晶法c,低温有机溶剂低温有机溶剂沉淀法沉淀法常用溶剂：常用溶剂：乙醇和丙酮乙醇和丙酮4、根据蛋白质、根据蛋白质电离性质的不同电离性质的不
7、同来纯化蛋白质来纯化蛋白质原原理理：利利用用离离子子交交换换剂剂为为固固定定相相，根根据据荷荷电电溶溶质质与与离离子交换剂之间子交换剂之间静电作用力的差别静电作用力的差别进行溶质分离。进行溶质分离。8蛋白质的离子交换剂蛋白质的离子交换剂：阴离子交换基：阴离子交换基：DEAEDEAE（二乙胺乙基）、（二乙胺乙基）、QAEQAE（季胺乙基）（季胺乙基）阳离子交换基：阳离子交换基：CMCM（羧甲基）、（羧甲基）、SPSP（磺丙基）、（磺丙基）、P P（膦酸基）（膦酸基）骨架材料：葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺骨架材料：葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺,纤维素纤维素商品化离子交换剂：商品化离子交换剂：D
8、EAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25离子交换条件选择原则离子交换条件选择原则1.对对已已知知等等电电点点的的物物质质，在在pH高高于于其其等等电电点点时时，用用阴阴离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂。离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂。2.等电点未知的物质，可参照电泳结果等电点未知的物质，可参照电泳结果3.若吸附太牢，可改用交换当量较小的交换剂或改变若吸附太牢，可改用交换当量较小的交换剂或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度条件降低交换剂上带电基团的解离度5、根据蛋白质、根据蛋白质功能专一性的不同功能专一性的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质亲亲
9、和和层层析析法法，即即利利用用蛋蛋白白质质分分子子能能与与其其相相应应的的配配体体进进行行特异的、非共价键的特异的、非共价键的可逆性可逆性结合结合而达到纯化的目的。而达到纯化的目的。固固相相化化金金属属亲亲和和层层析析（IMAC）利利用用蛋蛋白白质质分分子子中中的的咪咪唑唑基基和和巯巯基基与与一一些些金金属属元元素素（如如Cu2、Zn2+等等）形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。形成配位结合，使蛋白质得到分离纯化。6、根根据据蛋蛋白白质质疏疏水水基基团团与与相相应应的的载载体体基基团团结结合合来来纯纯化化蛋白质蛋白质原原理理：蛋蛋白白质质分分子子表表面面的的疏疏水水区区与与吸吸附附剂剂上上的的
10、疏疏水水基基团团结结合合，再再用用洗洗脱脱剂剂（调调节节离离子子强强度度、极极性性、PH)将蛋白质洗脱下来。将蛋白质洗脱下来。方法：方法：疏水性相互作用层析疏水性相互作用层析应应用用：用用含含酚酚基基疏疏水水基基团团的的琼琼脂脂糖糖纯纯化化重重组组人人表表皮皮生生长长因因子子（rhEGF），纯纯度度可可达达94%，回回收收率率达达82%。7、根据蛋白质的、根据蛋白质的选择性吸附性质选择性吸附性质来纯化蛋白质来纯化蛋白质 常常用用吸吸附附剂剂：结结晶晶磷磷酸酸钙钙（羟羟灰灰石石）、磷磷酸酸钙钙凝凝胶胶、硅硅胶胶、皂皂土土沸沸石石、硅硅藻藻土土、活活性性白白土土、氧氧化化铝铝以以及及活活性炭等。性
11、炭等。应应用用：催催产产素素、胰胰岛岛素素、HCG、HMG、细细胞胞包包素素C等的纯化等的纯化8、根据蛋白质、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质来纯化蛋白质 逆逆流流分分溶溶：以以化化合合物物在在两两个个不不相相溶溶的的液液相相之之间间进进行行分分配为基础的分离过程配为基础的分离过程 应用应用：垂体激素、氨基酸、：垂体激素、氨基酸、DNA等的纯化等的纯化。9、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质二、多肽与蛋白质的化学合成二、多肽与蛋白质的化学合成液相合成法液相合成法在有机溶剂中进行的均相在有机溶剂中进行的均相反应，始于反应，始于50
12、年代年代适用范围适用范围：分子量不太大：分子量不太大的多肽（的多肽（30肽以下）肽以下）缺点缺点：合成分子量较大的：合成分子量较大的蛋白质时，产物不能表现出蛋白质时，产物不能表现出全部活力且不能结晶全部活力且不能结晶固相合成法固相合成法 始于始于1962年年适用范围适用范围：小肽的合成（：小肽的合成（30肽以下）肽以下）缺点缺点：对大分子的合成，还：对大分子的合成，还不能达到天然物质的全部活力不能达到天然物质的全部活力（如（如124肽的核糖核酸酶）肽的核糖核酸酶）。多肽合成的几个主要步骤：多肽合成的几个主要步骤：氨基保护和羧基活化；氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；羧基保护和氨基活化；接
13、肽和除去保护基团。接肽和除去保护基团。（一）基团保护（一）基团保护保护基必须具备的条件保护基必须具备的条件（1）易在预定的部位引入）易在预定的部位引入（2）易除去）易除去（3）引入和除去保护基时，分子中的其它部位不会受到）引入和除去保护基时，分子中的其它部位不会受到影响，特别是已接好的肽键。影响，特别是已接好的肽键。氨基保护剂：氨基保护剂：苄氧羰酰氯（苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）可可用用催催化化氢氢化化法法或或钠钠氨氨法法（用用金金属属钠钠在在液液氨氨中中处处理理）除去保护基除去保护基叔叔丁丁氧氧羰羰酰酰氯氯（BOC-Cl）用用稀稀盐盐酸酸或或乙乙酸酸在在室室温温除除去保护基。去保护基。氯甲酸苄
14、酯氯甲酸苄酯氯甲酸苄酯氯甲酸苄酯Benzoxycarbonyl（简写（简写Z）羧基保护剂羧基保护剂种类种类：乙醇或甲醇：乙醇或甲醇引引入入：无无水水乙乙醇醇或或甲甲醇醇在在盐盐酸酸存存在在下下进进行行酯酯化化，使使羧基接上烷基。羧基接上烷基。脱除脱除：常温下，氢氧化钠皂化法。：常温下，氢氧化钠皂化法。侧链侧链的保护的保护His咪唑基咪唑基、Ser羟基羟基、Tyr酚基酚基、Cys巯基巯基等的保护等的保护保护剂：苄基（保护剂：苄基（B2），钠氨法除去。），钠氨法除去。Glu和和Asp的的及及-羧基羧基的保护的保护保护剂：保护剂：-及及-苯甲酯，催化氢化法除去。苯甲酯，催化氢化法除去。Arg胍基胍基
15、的保护的保护保护剂：对甲基磺酰基（保护剂：对甲基磺酰基（Tos-）。）。（二）肽的液相合成法（二）肽的液相合成法阶梯伸长法阶梯伸长法片断缩合法片断缩合法1.阶梯伸长法阶梯伸长法 定义：定义：将带有将带有R-O-CO-型保护基型保护基的氨基酸（不是肽）的的氨基酸（不是肽）的羧基羧基活化活化，从肽的，从肽的C-端开始端开始每次接上一个氨基酸，逐步递每次接上一个氨基酸，逐步递增的办法。增的办法。适用范围适用范围：合成比较小的肽或肽段：合成比较小的肽或肽段。根据羧基活化方法不同根据羧基活化方法不同,又分为又分为:混合酸酐法和活化酯混合酸酐法和活化酯法法 注注意意：一一般般采采用用羧羧基基活活化化的的方
16、方法法，合合成成肽肽的的常常规规方方法法是是从从C-端端向向N-端端进进行行。（原原因因：活活化化氨氨基基的的反反应应激激烈烈，且且常常常常产生消旋化）产生消旋化）活活化化酯酯法法（带带有有氨氨基基保保护护的的氨氨基基酸酸对对硝硝基基芳芳香香族族酯酯与与另一氨基酸酯的氨基缩合成肽）另一氨基酸酯的氨基缩合成肽）DCC+N-端保护的端保护的Aa(R1CO)2OR2-NH2R1-CO-NH-R2j混合酸酐法混合酸酐法-DCC法：加入碳二亚胺缩合剂法：加入碳二亚胺缩合剂H-Gly-OMEZ-Leu-OC6H4NO2Z-Leu-Gly-OME2.片断缩合法片断缩合法片片断断缩缩合合法法是是由由小小肽肽缩
17、缩合合成成大大肽肽的的方方法法，为为避避免免消消旋旋，常用常用叠氮法叠氮法接肽。接肽。优点：产品光学纯度高（不消旋）。优点：产品光学纯度高（不消旋）。（三）肽的固相合成法（三）肽的固相合成法定定义义：在在不不溶溶性性的的聚聚苯苯乙乙烯烯树树脂脂载载体体上上进进行行肽肽链链的的延长。延长。过程过程：1.C-末端的固定末端的固定合合成成多多肽肽的的C-末末端端先先和和氯氯甲甲基基聚聚苯苯乙乙烯烯树树脂脂（氯氯化化苄苄酯树脂）反应形成酯树脂）反应形成苄酯苄酯2.接肽接肽按按肽肽链链一一级级结结构构的的顺顺序序将将氨氨基基端端已已被被保保护护的的氨氨基基酸酸逐逐个加上个加上去，使肽链延长。去，使肽链延
18、长。在多肽合成中通常采用在多肽合成中通常采用氨基保护氨基保护,羧基活化的羧基活化的方法方法n n多肽固相合成原理的发明多肽固相合成原理的发明多肽固相合成原理的发明多肽固相合成原理的发明19631963年年年年美国洛克菲勒大学教美国洛克菲勒大学教美国洛克菲勒大学教美国洛克菲勒大学教授授授授 Robert.BruceMerrifieldRobert.BruceMerrifield发明了肽的固相合成法发明了肽的固相合成法发明了肽的固相合成法发明了肽的固相合成法（BOCBOC法）法）法）法）,成功地合成出成功地合成出成功地合成出成功地合成出了舒缓激肽（了舒缓激肽（了舒缓激肽（了舒缓激肽（9 9肽）和具
19、有肽）和具有肽）和具有肽）和具有124124个氨基酸残基的核糖核酸个氨基酸残基的核糖核酸个氨基酸残基的核糖核酸个氨基酸残基的核糖核酸酶酶酶酶,并因此于并因此于并因此于并因此于19841984年获得了年获得了年获得了年获得了诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。Robert.BruceMerrifieldRobert.BruceMerrifield(1921-May,2006)固固相相法法合合成成多多肽肽反反应应示示意意图图羧基通过羧基通过N,N-二环己二环己基碳二亚胺（基碳二亚胺（DCC,Dicyclohexylcarbodiimide）活化）活化 BOC法固相合成多肽示意图法固相
20、合成多肽示意图固相合成多肽的常用方法：固相合成多肽的常用方法：t-BOC法法氨氨基基用用叔叔丁丁氧氧羰羰基基保保护护，最最后后一一步步脱脱保保护护和和水水解解应应用用强酸强酸HF，条件苛刻，不适宜于短肽的大规模自动化合成，条件苛刻，不适宜于短肽的大规模自动化合成Fmoc法法 现现在在大大多多采采用用Fmoc法法（by R.C.Sheppard at CambridgeUniversity）氨氨基基用用9-芴芴甲甲氧氧羰羰基基保保护护，最最后后一一步步脱脱保保护护和和水水解解反反应用弱酸应用弱酸TFA(三氟乙酸），条件温和，反应易监控。三氟乙酸），条件温和，反应易监控。9-芴甲氧羰酰氯芴甲氧羰酰
21、氯固固相相法法合合成成多多肽肽优优点点：最最初初的的反反应应物物和和产产物物都都是是连连接接在在固固相相载载体体上上，故故可可在在一一个个反反应应容容器器中中进进行行所所有有的的反反应应，大大大大减减轻轻了了每每步步产产品品提提纯纯的的难难度度，便便于于自自动动化化操操作，可获得高产率，产物易分离。作，可获得高产率，产物易分离。目目目目前前前前化化化化学学学学合合合合成成成成多多多多肽肽肽肽可可可可以以以以在在在在程程程程序序序序控控控控制制制制的的的的自自自自动动动动化化化化多多多多肽肽肽肽合合合合成成成成仪仪仪仪上进行上进行上进行上进行 研研究究型型多多肽肽合合成成仪仪生产型多肽合成仪生产
22、型多肽合成仪中式型中中试试型型多多肽肽合合成成仪仪研究型多肽合成仪研究型多肽合成仪固相法合成的多肽产品固相法合成的多肽产品：催产素催产素催产素催产素(9(9肽肽肽肽)、促黄体生成素释放因子（、促黄体生成素释放因子（、促黄体生成素释放因子（、促黄体生成素释放因子（LRHLRH，9 9肽肽肽肽）、）、）、）、胸腺肽（胸腺肽（胸腺肽（胸腺肽（5 5肽），肽），肽），肽），产量高，而且比天然产品好。产量高，而且比天然产品好。产量高，而且比天然产品好。产量高，而且比天然产品好。（四）游离肽的获得（四）游离肽的获得（四）游离肽的获得（四）游离肽的获得 分离纯化：分离纯化：分离纯化：分离纯化：结晶法，层析法
23、，等电点沉淀法，超滤法结晶法，层析法，等电点沉淀法，超滤法结晶法，层析法，等电点沉淀法，超滤法结晶法，层析法，等电点沉淀法，超滤法 产品干燥产品干燥产品干燥产品干燥：真空冷冻干燥或冷冻干燥真空冷冻干燥或冷冻干燥真空冷冻干燥或冷冻干燥真空冷冻干燥或冷冻干燥（避免失活）（避免失活）（避免失活）（避免失活）第二节第二节 多肽类药物多肽类药物一、概述一、概述活性多肽来源活性多肽来源：生物体的组织、细胞、体液等生物体的组织、细胞、体液等人工合成人工合成第一个人工合成的活性多肽催产素（第一个人工合成的活性多肽催产素（1953年）年）神经肽神经肽，细胞生长调节因子（，细胞生长调节因子（60、70年代年代）酶
24、催化酶催化无活性的蛋白质前体无活性的蛋白质前体酶加工剪切转化酶加工剪切转化活性蛋白质、多肽活性蛋白质、多肽多肽药物的种类多肽药物的种类多肽激素多肽激素垂垂体体多多肽肽激激素素、下下丘丘脑脑激激素素、甲甲状状腺腺激激素素、胰胰岛岛激素激素、胸腺激素、胸腺激素多肽类细胞生长调节因子多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子表皮生长因子（EGFEGF）、转移因子、转移因子（TFTF）、）、心钠素心钠素（ANPANP）含有多肽成分的其他生化药物含有多肽成分的其他生化药物 蜂毒（肽）、蛇毒（肽）蜂毒（肽）、蛇毒（肽）蜂毒（肽）、蛇毒（肽）蜂毒（肽）、蛇毒（肽）二、主要多肽类药物的制备二、主要多肽类药物的制备（一
25、）胸腺激素（一）胸腺激素（Thymushormones）作作用用：对对免免疫疫功功能能（免免疫疫缺缺陷陷病病、自自身身免免疫疫性性疾疾病病、恶性肿瘤以及老年性退化性病变）有多方面的影响。恶性肿瘤以及老年性退化性病变）有多方面的影响。用途：免疫调节剂用途：免疫调节剂1、胸腺素（、胸腺素（Thymocln）来源：小牛胸腺来源：小牛胸腺（1）结构和性质）结构和性质1)由由4050种多肽组成的种多肽组成的混合物混合物2)80热稳定热稳定3)分子量在分子量在100015000之间之间4)等电点在等电点在3.59.5之间。之间。根根据据等等电电点点以以及及在在等等电电聚聚焦焦分分离离时时的的顺顺序序而而命
26、命名名，共分三个区域：共分三个区域：区区：PI低于低于5.0的组分，的组分，区区：PI在在5.07.0之间的组分，之间的组分，区区:PI在在7.0以上者（此区内组分很少）。以上者（此区内组分很少）。有活性的称为胸腺素有活性的称为胸腺素，如胸腺素，如胸腺素11，无活性的称之为多肽无活性的称之为多肽，如多肽，如多肽11。（2 2）生产工艺：）生产工艺：除杂蛋白：除杂蛋白：热变性法（要求目标蛋白有较高的热稳定性）热变性法（要求目标蛋白有较高的热稳定性）沉淀：沉淀：-10丙酮丙酮,避免有机溶剂引起蛋白失活避免有机溶剂引起蛋白失活硫酸铵分级沉淀：硫酸铵分级沉淀：2550饱和度饱和度超滤：取透过液超滤：取
27、透过液（MW物质物质PI，带负电，选阴离子交换剂，带负电，选阴离子交换剂介质介质PHPI,蛋白质带负电，蛋白质带负电，在在pH5.5-9.0范围内蛋白范围内蛋白质和质和DEAE离子交换剂都离子交换剂都是解离的，带相反电荷是解离的，带相反电荷当当pH60析出沉淀析出沉淀)。稳定性：对酸较稳定，较其他血浆蛋白质稳定性：对酸较稳定，较其他血浆蛋白质耐热（氯化钠或脂肪酸盐可提高其热稳定耐热（氯化钠或脂肪酸盐可提高其热稳定性）性）分类：人血清白蛋白分类：人血清白蛋白(健康人血浆健康人血浆)、胎盘、胎盘血白蛋白（健康产妇胎盘血）血白蛋白（健康产妇胎盘血）血浆蛋白血浆蛋白 2 2、生产工艺、生产工艺(5)除
28、菌：先用压滤器澄清过滤，再用除菌：先用压滤器澄清过滤，再用冷灭菌冷灭菌 系统系统除菌除菌上清液供生产人丙种球蛋白上清液供生产人丙种球蛋白(1)利凡诺利凡诺：乳酸依沙吖啶：乳酸依沙吖啶,白蛋白沉淀剂白蛋白沉淀剂，充分搅拌、静置充分搅拌、静置2-4h,分离上清液与络分离上清液与络合沉淀合沉淀(2)解离：解离：pH弱酸性弱酸性,加加0.15-0.2NaCL，不断搅拌解离，不断搅拌解离,65恒温恒温1h,冷却、离冷却、离心、过滤（压滤机）心、过滤（压滤机）(3)浓缩浓缩：超滤：超滤(4)热处理：灭活病毒热处理：灭活病毒冷灭菌技术冷灭菌技术n n定义：定义：定义：定义：冷灭菌是一种不用热能杀死微生物的新
29、技术。与传统冷灭菌是一种不用热能杀死微生物的新技术。与传统冷灭菌是一种不用热能杀死微生物的新技术。与传统冷灭菌是一种不用热能杀死微生物的新技术。与传统的热灭菌相比，不仅能的热灭菌相比，不仅能的热灭菌相比，不仅能的热灭菌相比，不仅能杀死微生物杀死微生物杀死微生物杀死微生物，保证产品安全，保证产品安全，保证产品安全，保证产品安全，同时还能较好地同时还能较好地同时还能较好地同时还能较好地保持产品的生物活性保持产品的生物活性保持产品的生物活性保持产品的生物活性。n冷灭菌方法冷灭菌方法：膜分离（微滤膜分离（微滤膜分离（微滤膜分离（微滤0.20.20.20.2 m m m m、0.450.450.450.
30、45 m m m m过滤细菌过滤细菌过滤细菌过滤细菌)、UHP UHP UHP UHP（超（超（超（超高压灭菌）、辐射灭菌、高压脉冲电场高压灭菌）、辐射灭菌、高压脉冲电场高压灭菌）、辐射灭菌、高压脉冲电场高压灭菌）、辐射灭菌、高压脉冲电场（二）干扰素（二）干扰素（InterferonInterferon，IFNIFN）1 1、结构和性质、结构和性质 特点特点：干扰素：干扰素诱生剂诱导诱生剂诱导所产生的一类高活性、多功能所产生的一类高活性、多功能的的诱生蛋白质诱生蛋白质。分类分类：人干扰素按抗原性分为：人干扰素按抗原性分为、三型。三型。（三种干扰素的理化及生物学性质有明显差异）（三种干扰素的理化
31、及生物学性质有明显差异）2 2、生产工艺、生产工艺干扰素的制备方法：干扰素的制备方法：人人白白细细胞胞培培养养 （以以血血库库血血大大量量制制备备，达达到到10106 6U Umgmg蛋蛋白白水平）水平）基基因因工工程程发发酵酵法法：重重组组人人-干干扰扰素素 、重重组组人人-干干扰扰素素国内已上市的干扰素品种国内已上市的干扰素品种：聚乙二醇干扰素聚乙二醇干扰素-2b注射剂注射剂 重组人干扰素重组人干扰素-2b注射液注射液重组人干扰素重组人干扰素-1b滴眼液滴眼液重组人干扰素重组人干扰素-2a栓、凝胶栓、凝胶注射用重组人干扰素注射用重组人干扰素-2a、-2b、-1b(1)(1)工艺路线（细胞培
32、养法）：工艺路线（细胞培养法）：PBS:磷酸钠缓冲液磷酸钠缓冲液（NaCl,Na2HPO4，NaH2PO4）透析：溶解液作内液透析：溶解液作内液PBS作外液，除作外液，除KSCN1.白细胞的分离：离心分离血浆，吸取灰黄层（白细胞白细胞的分离：离心分离血浆，吸取灰黄层（白细胞+红细胞），用氯化铵红细胞），用氯化铵（0.83%）裂解红细胞，离心，收集白细胞，制成白细胞悬液）裂解红细胞，离心，收集白细胞，制成白细胞悬液 2.起动与诱生起动与诱生 加少许白细胞干扰素，加少许白细胞干扰素，37培养培养h，再加适量诱生病毒，再加适量诱生病毒，37培培养养12h，收集上清即为粗制干扰素，收集上清即为粗制干扰
33、素，20保存。保存。3.纯化纯化：KSCN（0.5mol/L,pH3.5）盐析，醇溶盐析，醇溶（94冷乙醇冷乙醇）、酸沉淀除杂蛋白，碱）、酸沉淀除杂蛋白，碱沉浓缩沉浓缩4.溶解（溶解（0.5mol/L硫氰化钾硫氰化钾0.1mol/LPBS，pH5.2）、透析除盐，除菌过滤、半成品、透析除盐，除菌过滤、半成品检定，合格后分装，冻干。检定，合格后分装，冻干。（2 2）注意事项：）注意事项：血血液液分分离离白白细细胞胞：含含ACDACD抗抗凝凝剂剂血血液液 离离心心血血浆浆灰黄层灰黄层氯化铵溶血（除红细胞）氯化铵溶血（除红细胞）离心离心白细胞白细胞 干干扰扰素素诱诱导导剂剂：仙仙台台病病毒毒（在在1
34、010天天龄龄鸡鸡胚胚中中培培养养484872h72h，收获尿囊液）或新城鸡瘟病毒，收获尿囊液）或新城鸡瘟病毒（NDV）株株 柠檬酸柠檬酸0.48g0.48g、柠、柠檬酸钠檬酸钠1.32g1.32g、葡、葡萄糖萄糖1.47g1.47g，加水，加水至至1000ml1000ml3 3、作用与用途、作用与用途作用作用：抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节：抗病毒、抗细胞分裂及免疫调节用途用途：（1 1）病病毒毒性性疾疾病病：普普通通感感冒冒、疱疱疹疹性性角角膜膜炎炎、带带状状疱疱疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。疹、水痘、慢性活动性乙型肝炎。（2 2）恶恶性性肿肿瘤瘤：成成骨骨肉肉瘤瘤、乳乳腺腺癌癌、多多发发性
35、性骨骨髓髓瘤瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等（3 3）病毒引起的良性肿瘤）病毒引起的良性肿瘤（三）胰岛素（三）胰岛素（InsrlinInsrlin）简介简介19221922年年从从胰胰脏脏中中提提取取得得到到的的一一种种较较纯纯的的降降血血糖糖物物质质，命命名名为胰岛素为胰岛素19231923年开始临床应用年开始临床应用我国在我国在19651965年完成了年完成了结晶牛胰岛素结晶牛胰岛素的的全合成全合成工作工作胰岛素是世界上胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质第一个人工合成的蛋白质迄今胰岛素仍是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药迄今胰岛素仍是治疗胰岛素依赖型糖尿病的特效药1
36、 1结构和性质结构和性质 （1 1）结构：）结构：由由5151个个AaAa组成组成，有，有A A和和B B两条链两条链A A链含链含2121个个AaAa残基；残基；B B链含链含3030个个AaAa残基残基A A、B B链链由由两两个个二二硫硫键键相相连连，A A链链本本身身还还含含有有一一个个二二硫硫键键 不不同同种种属属动动物物胰胰岛岛素素的的分分子子结结构构大大致致相相同同，差差别别主主要要在：在：A A链二硫桥中间的第链二硫桥中间的第8 8、9 9和和1010位上的三个位上的三个AaAaB B链链C C末端的一个末端的一个AaAa上上人胰岛素人胰岛素B30苏氨酸苏氨酸猪、牛胰岛素猪、牛
37、胰岛素B30丙氨酸丙氨酸人、猪胰岛素（人、猪胰岛素（A链链8，9，10位位Aa）：苏、丝、异亮）：苏、丝、异亮牛胰岛素（牛胰岛素（A链链8，9，10位位Aa）：丙、丝、缬：丙、丝、缬猪胰岛素结构图猪胰岛素结构图B链链C末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸末端人的是苏氨酸，猪的是丙氨酸,抗原性比其他来源的胰岛素要低。抗原性比其他来源的胰岛素要低。临床应用的动物胰岛素以临床应用的动物胰岛素以猪胰岛猪胰岛素为主，其抗原性比其他来源（牛、马、羊素为主，其抗原性比其他来源（牛、马、羊、兔、狗）的胰岛素要低、兔、狗）的胰岛素要低。（2 2）胰岛素在体内的存在形式）胰岛素在体内的存在形式）胰岛素在体内的存在形式）
38、胰岛素在体内的存在形式n n胰岛素由胰岛的胰岛素由胰岛的胰岛素由胰岛的胰岛素由胰岛的 细胞细胞细胞细胞产生，在产生，在产生，在产生，在 细胞中开始细胞中开始细胞中开始细胞中开始时是以时是以时是以时是以活性很弱活性很弱活性很弱活性很弱的的的的前体前体前体前体胰岛素原胰岛素原胰岛素原胰岛素原存在，进而存在，进而存在，进而存在，进而分解为分解为分解为分解为胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素进入血液循环进入血液循环进入血液循环进入血液循环胰岛素原经蛋白酶水解切除胰岛素原经蛋白酶水解切除C肽，得活性的胰岛素肽，得活性的胰岛素胰岛素原是由胰岛素原是由C肽的一端与胰岛素肽的一端与胰岛素A链链N-末端相连，另一端与末端
39、相连，另一端与B链链C末端相连末端相连（3 3）胰岛素的性质：）胰岛素的性质：分子量分子量：牛胰岛素为牛胰岛素为57335733，猪为，猪为57645764，人为，人为57845784。等电点等电点：5.305.305.355.35。溶解性溶解性：在：在pH4.5pH4.56.56.5范围内几乎不溶于水，范围内几乎不溶于水，易溶于稀易溶于稀酸酸或稀碱溶液；或稀碱溶液；在在80%80%以下乙醇或丙酮中溶解以下乙醇或丙酮中溶解；在；在90%90%以以上乙醇或上乙醇或80%80%以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶。在在高浓高浓度锌的溶液度锌的溶液中，中，pH6pH68 8时胰
40、岛素时胰岛素溶解度急剧下降溶解度急剧下降 。稳定性稳定性：在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定：在弱酸下或混悬在中性缓冲液中稳定2.2.生产工艺生产工艺（1 1）酸醇法制备胰岛素工艺路线）酸醇法制备胰岛素工艺路线胰尾（胰岛素含量胰尾（胰岛素含量高）高）提取：胰片提取：胰片86-88乙醇乙醇5草酸；滤渣：草酸；滤渣：68-70乙醇乙醇0.4草酸草酸碱化：浓氨水除碱性蛋白（压滤）碱化：浓氨水除碱性蛋白（压滤）酸化：硫酸除酸性蛋白酸化：硫酸除酸性蛋白减压浓缩：上层清液，低于减压浓缩：上层清液，低于30，减压蒸馏浓缩、除乙醇，减压蒸馏浓缩、除乙醇去脂：速热（去脂：速热（50）速冷（）速冷（5）盐析：盐析：
41、NaCL(27%)除酸性蛋白：除酸性蛋白：H4.2-4.3低温丙酮沉淀、低温静置、低温离心低温丙酮沉淀、低温静置、低温离心锌沉淀锌沉淀:加醋酸锌溶液，与等电点沉淀配合使用加醋酸锌溶液，与等电点沉淀配合使用 除碱性蛋白、结晶、丙酮乙醚脱水除碱性蛋白、结晶、丙酮乙醚脱水3 3、注意事项、注意事项（1 1）冻冻胰胰：离离体体后后，需需立立即即深深冻冻（蛋蛋白白水水解解酶酶分分解解胰胰岛岛素素）。-30-30以以下下急急冻冻后后转转入入-20-20保保存存备备用用。液液氮氮或或干干冰冰速速冻，效果更好。冻，效果更好。胰尾胰岛素含量较高，单独使用，收率可提高胰尾胰岛素含量较高，单独使用，收率可提高10%
42、10%。（2 2）结晶胰岛素的纯度）结晶胰岛素的纯度国国 外外 标标 准准：胰胰 岛岛 素素 原原（10ppm)10ppm)、脱脱 酰酰 胺胺 胰胰 岛岛 素素(1000ppm)(1000ppm)我国：胰岛素原含量约为我国：胰岛素原含量约为我国：胰岛素原含量约为我国：胰岛素原含量约为20000ppm20000ppm20000ppm20000ppm 胰岛素的发展胰岛素的发展胰岛素的发展胰岛素的发展 动物胰岛素动物胰岛素动物胰岛素动物胰岛素重组人胰岛素重组人胰岛素重组人胰岛素重组人胰岛素胰岛素类似物胰岛素类似物胰岛素类似物胰岛素类似物存在免疫原性存在免疫原性问题问题 不能模拟生理性不能模拟生理性胰
43、岛素分泌模式胰岛素分泌模式作用时间、作作用时间、作用效果更佳用效果更佳（提取或合成）（提取或合成）基因工程菌或半合成基因工程菌或半合成分子改造或修饰分子改造或修饰胰岛素结构改造和修饰胰岛素类似物胰岛素结构改造和修饰胰岛素类似物优优点点：起起效效快快、降降糖糖能能力力高高、半半衰衰期期长长、抗抗热热变变性性、抗蛋白水解酶的降解等。抗蛋白水解酶的降解等。产品：产品：1)重重组组赖赖辅辅胰胰岛岛素素：人人胰胰岛岛素素B链链的的28位位、29位位脯脯氨氨酸酸和和赖赖氨酸的顺序换位氨酸的顺序换位 2)门门冬冬胰胰岛岛素素：利利用用啤啤酒酒酵酵母母属属，采采用用重重组组DNA技技术术，将将人人胰岛素氨基酸
44、链胰岛素氨基酸链B28位的脯氨酸由天门冬氨酸替代位的脯氨酸由天门冬氨酸替代 3)右旋糖酐胰岛素右旋糖酐胰岛素（化学修饰）（化学修饰）酶促半合成人胰岛素酶促半合成人胰岛素经经胰胰蛋蛋白白酶酶的的转转酰酰胺胺作作用用，将将猪猪胰胰岛岛素素转转化化为为人人胰胰岛岛素素B B3030。再再用用离离子子交交换换层层析析纯纯化化，可可得得到到高高纯纯度度人人胰胰岛素。岛素。胰蛋白酶胰蛋白酶猪胰岛素猪胰岛素B30丙氨酸丙氨酸人胰岛素人胰岛素B30苏氨酸苏氨酸重组人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的生产方法重组人胰岛素的生产方法1)用基因工程大肠杆菌用基因工程大肠杆菌(Escherichia
45、 coli,E.coli)分别分别发酵生产人胰岛素发酵生产人胰岛素(human insulin,hI)的的A、B链链,然后经然后经化学再氧化法化学再氧化法,使两条链在一使两条链在一定条件下重新形成二硫键定条件下重新形成二硫键,得得到到hI。（目前已较少使用）。（目前已较少使用）2)2)用基因工程用基因工程E.coliE.coli发酵生产人胰岛素原发酵生产人胰岛素原(human(human proinsulin,hPI),proinsulin,hPI),后经加工形成后经加工形成hIhI。优点：优点：E.coliE.coli系统表达量高系统表达量高缺点：产物易降解缺点：产物易降解,故常采用融和蛋白
46、形式将故常采用融和蛋白形式将hPIhPI连接连接在一个较大的蛋白质后在一个较大的蛋白质后,表达产物需经过一系列复杂表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的的后加工才能形成有活性的hIhI3)通过基因工程酵母菌发酵生产通过基因工程酵母菌发酵生产hPI,经后加工形成经后加工形成hI。优点：酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单优点：酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单缺点：生产周期长缺点：生产周期长,且重组蛋白分泌量少且重组蛋白分泌量少(1(150 50 mg/L),mg/L),产量低产量低（四）生长素（四）生长素（Growth hormoneGrowth hormone，GHGH）1 1、
47、结构和性质、结构和性质 人生长激素由人生长激素由191191个个AaAa组成，组成，PI4.9PI4.9，（猪为，（猪为6.36.3）稳稳定定性性好好，其其活活性性在在冰冰冻冻条条件件下下可可保保持持数数年年，在在室室温温放置放置48h48h无变化。无变化。只有灵长类的生长激素对人有活性。只有灵长类的生长激素对人有活性。2 2、生产工艺、生产工艺用含NaCL的Tris-HCl洗脱（2 2）工艺解析：）工艺解析：提取提取：加水制匀浆，取沉淀：加水制匀浆，取沉淀 沉淀先用沉淀先用0.1 mol/L0.1 mol/L硫酸铵抽提（取沉淀），再用硫酸铵抽提（取沉淀），再用0.25 mol/L0.25 m
48、ol/L硫酸铵抽提硫酸铵抽提 （取上清）（取上清）分级沉淀分级沉淀：硫酸铵硫酸铵 1 11.8mol/L (1.8mol/L (盐析沉淀）盐析沉淀）一次沉淀：取上清二次沉淀：取沉淀一次沉淀：取上清二次沉淀：取沉淀 凝胶过滤凝胶过滤 Sephadex G-75 Sephadex G-75，用含，用含NaCLNaCL的的Tris-Tris-HClHCl洗脱洗脱 DEAE-C DEAE-C层析层析：酸性蛋白适合用阴离子交换剂：酸性蛋白适合用阴离子交换剂 注意：当透析与凝胶过滤或离子交换组合操作时，注意：当透析与凝胶过滤或离子交换组合操作时，一般选择一般选择与洗脱剂相似的透析外液与洗脱剂相似的透析外液
49、。3.3.3.3.人生长素（人生长素（人生长素（人生长素（hGH)hGH)hGH)hGH)的研制的研制的研制的研制动物生长素不能用于人体动物生长素不能用于人体传统方法：从人尸体的脑垂体中提取传统方法：从人尸体的脑垂体中提取传统方法：从人尸体的脑垂体中提取传统方法：从人尸体的脑垂体中提取生物技术：重组枯草杆菌系统表达生物技术：重组枯草杆菌系统表达生物技术：重组枯草杆菌系统表达生物技术：重组枯草杆菌系统表达hGHhGHhGHhGH产量达产量达产量达产量达1.5g/L1.5g/L1.5g/L1.5g/L4.4.4.4.临床用途临床用途临床用途临床用途治疗因垂体功能不全而引起的侏儒症治疗因垂体功能不全
50、而引起的侏儒症治疗因垂体功能不全而引起的侏儒症治疗因垂体功能不全而引起的侏儒症（五）胃膜素（五）胃膜素（Gastricmucin）1 1、结构和性质、结构和性质 来源来源：猪胃粘膜：猪胃粘膜 主要成分主要成分：粘蛋白：粘蛋白 性质性质：遇水后膨胀成为粘液，遇酸即沉淀，遇热不凝固。遇水后膨胀成为粘液，遇酸即沉淀，遇热不凝固。其水溶液能被其水溶液能被6060以上乙醇或丙酮沉淀。以上乙醇或丙酮沉淀。与与酸酸较较长长时时作作用用，能能分分解解成成各各种种蛋蛋白白质质和和多多糖糖组组分分。等电点为等电点为pH3.3pH3.35 5。2 2、生产工艺、生产工艺胃膜素、胃蛋白酶联产工艺胃膜素、胃蛋白酶联产工