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1、第八章第八章基因工程育种基因工程育种第一节第一节 基因工程育种基因工程育种概述概述第二节第二节 重要的重要的工具酶工具酶第三节第三节 常用的载体常用的载体第四节第四节 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程第五节第五节 基因工程育种的应用基因工程育种的应用主要内容主要内容第一节 基因工程育种概述Cohen和和Boyverl973年年首首次次成成功功完完成成了了DNA分分子子的的体体外外重重组组实实验验，宣宣告告基基因因工工程程(geneengineering)的诞生，也为微生物育种带来了一场革命。的诞生，也为微生物育种带来了一场革命。基因工程育种基因工程育种广义的基因工程育种包括所有利用广义
2、的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术重组技术将外源基因导入到微生物细胞将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的，使后者获得前者的某些某些优良性状优良性状或者利用后者作为表达场所来或者利用后者作为表达场所来生产目生产目的产物的产物。基因工程育种的优势基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交实现真正意义上的远缘杂交。而且。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工动物、植物、
3、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，程方法，人们可以人们可以“随心所欲随心所欲”地进行自然演化过程中地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这是这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。种技术，是最新、最有前途的育种方法。第二节 重要的工具酶工工具酶具酶 基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶主主要要是是指指用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的的切切割割、连连接接、聚聚合合、修修饰饰、反反转转录录等等有有关关的的各各种种酶酶系系
4、统。统。一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，的核酸内切酶，简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类：、和和型，型，其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。限制限制酶酶（型）型）识别识别及切割位点及切割位点 特异特异识别识别及切割及切割4 8个个bp长长度且具有度且具有回文序列回文序列的的DNA片断，主要片断，主要产产生生3种缺口：种缺口：5粘性末端
5、粘性末端 3粘性末端粘性末端 平平头头末端末端 回文序列回文序列 是指是指该该部位的核苷酸序列呈部位的核苷酸序列呈180O旋旋转对转对称称;粘性末端粘性末端 是指是指经经内切内切酶酶特异切割后特异切割后产产生的生的5末端突出或末端突出或3末端突出的碱基序列，相互具有互末端突出的碱基序列，相互具有互补补性性。其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶同裂同裂酶酶 又称异源同工又称异源同工酶酶。指来源不同，但具有。指来源不同，但具有相同的相同的识识别别序列序列。在切割在切割DNA时时，其，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，的，产产
6、生平生平头头末端，称末端，称为为同同识识同切同切；切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，的，产产生生3或或5粘性末端，称粘性末端，称为为同同识识异切异切。同裂同裂酶酶同识同识同同切切同裂同裂酶酶同识同识异异切切同同尾尾酶酶 同尾同尾酶酶 指来源不同，但指来源不同，但识别识别与切割与切割顺顺序有一定的相关性序有一定的相关性的一的一类类酶酶。它。它们们作用后作用后产产生相同生相同的的粘性末端粘性末端。可可变变酶酶可可变变酶酶 识别顺识别顺序中的一个或几个碱基是可序中的一个或几个碱基是可变变的，的，并且并且识别顺识别顺序往往超序往往超过过6个碱基个碱基对对。如，如，Bstp，其，其识别顺识别顺序序
7、为为GGTNACC。常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coliRY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌HindAAGCTTHsuProvidencia stuartii164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyce
8、s albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho二、二、DNA聚合聚合酶酶（最常用的最常用的DNA聚合聚合酶酶有以下有以下4种种）DNA聚合聚合酶酶 DNA聚合聚合酶酶大片段大片段Klenow片段片段 Taq DNA聚合聚合酶酶 T4 噬菌体噬菌体DNA聚合聚合酶酶 DNA聚合聚合酶酶 E.Coli DNA聚合聚合酶酶（DNA pol）是一个具有是一个具有3 种种酶酶活性的多功能性活性的多功能性酶酶。包括：包括：53DNA DNA 聚合聚合酶酶活性活性 53核酸外切核酸外切酶酶活性活性 35核酸外切核酸外切酶酶活性活性 DNA po
9、l 应应用用 催化催化DNA缺口平移反缺口平移反应应，制，制备备高比活性高比活性DNA 探探针针；第二条第二条cDNA链链的合成；的合成；对对DNA3突出末端突出末端进进行行标记标记；DNA序列分析。序列分析。E.coli DNA pol 催化切口平移 Klenow片段（片段（DNA pol.大片断）大片断）Klenow片段用途片段用途 补齐补齐双双链链DNA的的 3末端；末端；用用标记标记碱基碱基补补 齐齐3末端末端；在在cDNA克隆中，克隆中，用于第二股用于第二股链链 的合成；的合成；DNA序列分析。序列分析。Taq DNA pol（耐（耐热热DNA聚合聚合酶酶）作用特点作用特点1）Taq
10、 DNA pol催化催化DNA合成的最适温度范合成的最适温度范围围 70 75，2）95以上高温，半小以上高温，半小时时不失活，不失活，3）最适合用于聚合最适合用于聚合酶酶链链反反应应（PCR）。）。三、逆三、逆转录转录酶酶 特点特点 逆逆转录转录酶酶是一个多功能性是一个多功能性酶酶，至少具有以下，至少具有以下3种种酶酶活性：活性：以以单链单链RNA 为为模板，模板，催化合成催化合成cDNA单链单链 具有具有RNase H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNA杂杂交交链链中中的的 RNA 以以DNA为为模板，催化合成模板，催化合成cDNA双双链链。逆逆转录转录酶酶的的应应用：用：将将mRNA
11、逆逆转录转录成成cDNA，构建，构建cDNA文文库库；补补平和平和标记标记5-末端突出的末端突出的DNA片段；片段；代替代替Klenow酶酶用于用于DNA序列分析；序列分析；制制备杂备杂交探交探针针等。等。四、四、DNA连连接接酶酶(DNA ligase)DNA连连接接酶酶可可以以 催催化化带带有有粘粘性性末末端端或或平平头头末末端端的的双双链链DNA中中一一条条链链的的3OH与与另另一一条条链链的的5PO3H2形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键而而相相连连，从从而而构构成成一一条条完完整整的的DNA长链长链。DNA连连接接酶酶的用途的用途（1）两个双两个双链链DNA片段片段连连接起来接起来 5-A
12、CG AATTCGT-3 5-ACG AATTCGT-3 T4DNA连连接接酶酶 5-ACGAATTCGT-3 5-ACGAATTCGT-3 3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2）修修补带补带有缺口的双有缺口的双链链DNA分子分子T4DNA连接酶连接酶五、碱性磷酸五、碱性磷酸酶酶 碱性磷酸碱性磷酸酶酶(BAP)能能够够催化水解去除催化水解去除DNA或或RNA5-端的磷酸基端的磷酸基团团。用途用途 制制备载备载体体时时，用碱性磷酸，用碱性磷酸酶酶处处理去除理去除载载体分子体分子 5端磷酸基后，可防止端磷酸基
13、后，可防止载载体自身体自身环环化化连连接，提高重接，提高重组组效率。效率。用用32P标记标记5-端前，去除端前，去除5-P，再通，再通过过激激酶酶作用把作用把放射性核苷酸加到放射性核苷酸加到5-端端进进行行标记标记。六、末端六、末端（脱氧核苷酸）（脱氧核苷酸）转转移移酶酶(TdT)作用作用 将将标标记记或或未未标标记记的的dNTP加加到到DNA的的3OH末末端端；也也可可催催化化载载体体分分子子或或待待克克隆隆的的DNA片片断断上上加加上上互互补补的的同同聚聚尾尾，便便于于进进一步一步连连接。接。应应用用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在
14、在载载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进进行行连连接接重要的工具重要的工具酶酶工具工具酶酶 活性活性 限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶 识别识别特异序列，切割特异序列，切割DNA T4 DNA连连接接酶酶 催化催化DNA5-磷酸与磷酸与3-羟羟基基 形成磷酸二形成磷酸二酯键酯键 DNA聚合聚合酶酶 以以DNA为为模板合成模板合成DNA 逆逆转录转录酶酶 以以RNA为为模板合成模板合成DNA 碱性磷酸碱性磷酸酶酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4多聚核苷酸激多聚核苷酸激酶酶 催化核酸催化核酸5-羟羟基磷酸化基磷酸化末端脱氧核苷酸末端脱氧核苷酸转转移移酶酶
15、催化催化3-端合成同聚体尾端合成同聚体尾第三节第三节 常用的载体常用的载体载载体体(vector)是将外源是将外源DNA(目的目的DNA)片断引入宿主片断引入宿主细细胞胞的运的运载载工具，其化学本工具，其化学本质为质为DNA。载载体必体必须须具具备备的基本条件的基本条件 载载体的种体的种类类 常用的常用的载载体体一、一、载载体必体必须须具具备备的基本条件的基本条件 有自身的有自身的复制子复制子，能独立复制，能独立复制 具具备备多个限制多个限制酶酶的的识别识别位点位点(多克隆位点多克隆位点)具有具有遗传遗传表型或表型或筛选筛选标记标记 有有足足够够的容量的容量以容以容纳纳外源外源DNA片段。片段
16、。表达型表达型载载体体还应还应具具备备与宿主与宿主细细胞相适胞相适应应的的启启动动 子、前子、前导导序列、增序列、增强强子子等等调调控元件。控元件。载载体体DNA中均有一段中均有一段非必需区非必需区，将外源基因插入，将外源基因插入 该该非必需区，而非必需区，而载载体本身不受影响。体本身不受影响。二、二、载载体的种体的种类类（一）（一）克隆克隆载载体体 用来克隆和用来克隆和扩扩增增DNA片段的片段的载载体，具有体，具有3点点共性共性：能能够够在受体在受体细细胞复制；胞复制；带带有有药药物抗性基因，便于物抗性基因，便于筛选筛选；可可导导入受体入受体细细胞。胞。（二）（二）表达表达载载体体 除具有克
17、隆除具有克隆载载体所具有的性体所具有的性质质外，外，还带还带有表达构件有表达构件转录转录和翻和翻译译所必所必须须的的DNA顺顺序。序。三、常用的三、常用的载载体体（一）（一）质粒质粒(plasmid)(plasmid)：是存在于是存在于细细菌染色体外的、能自主复制的双菌染色体外的、能自主复制的双链环链环状状DNA分子。分子。作作为为克隆克隆载载体的体的质质粒粒应应具具备备以下特点：以下特点：1.分子量相分子量相对较对较小，能小，能稳稳定存在于定存在于细细菌体内，菌体内，有有较较高的拷高的拷贝贝数数 2.具有具有1个以上的个以上的遗传标遗传标志，便于志，便于筛选筛选 3.具有多克隆位点具有多克隆
18、位点 广泛广泛应应用的用的质质粒：粒：pBR32质质粒、粒、pUC系列等系列等pBR322质质粒粒 4363 bp 4363 bp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标含一个抗氨卞青霉素标 记记(ampampR R)一个抗四环素标记一个抗四环素标记 (tettetR R)ampampR R和和tettetR R基因内各有基因内各有一些限制酶的酶切位点，一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入供外源基因插入 当外原基因插入抗药当外原基因插入抗药基因位点时，基因位点时，AmpAmpR RAmpAmp敏敏感感(AmpAmpS S)、TetTetR RTetTet敏敏感感(TetTetS S).)
19、.pUC系列质粒系列质粒 由由pBR322pBR322和和M13M13噬噬菌菌体体构构建而成的双链质粒载体；建而成的双链质粒载体；（1 1）2674bp 2674bp；（2 2）有有ampampr r和与和与M13M13噬菌体噬菌体 相同的多克隆位点（相同的多克隆位点（MCSMCS）（3 3）有有一一个个来来自自大大肠肠杆杆菌菌的的LacZLacZ操操纵纵子子的的DNADNA片片断断,编编码半乳糖苷酶码半乳糖苷酶 (二二)噬菌体噬菌体 组组成特点成特点：双双链线链线状状DNA分子，分子，全全长长50kb，含含65个基因，个基因，在其分子两端各含有在其分子两端各含有12个碱基的互个碱基的互补单链
20、补单链，是天，是天然的粘性末端，被称然的粘性末端，被称为为COS位点。位点。噬菌体感染噬菌体感染细细菌后的溶菌性生菌后的溶菌性生长长和溶源性生和溶源性生长长 溶菌性生溶菌性生长长（lytic pathway）噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，借借助助其其2个个COS位位点点互互补补成成环环，在在宿宿主主菌菌体体内内连连续续复复制制，合合成成大大量量基基因因产产物物，进进而而装装配配成成噬噬菌菌体体颗颗粒，粒，裂解宿主菌裂解宿主菌，释释放出来的噬菌体又可感染其他放出来的噬菌体又可感染其他细细菌。菌。溶源性生溶源性生长长(lysogenic pathway)噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，可可将
21、将自自身身DNA整整合合到到细细菌菌的的染染色色体体中中去去，与与之之一一起起复复制制，并并遗遗传传给给子子代代细细胞胞，宿宿主主细细胞胞不不被被裂裂解解。第四节第四节 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程 基因工程原理基因工程原理一、目的基因的一、目的基因的获获取（取（分分）目的基因目的基因 是是指指所所要要研研究究或或应应用用的的基基因因，也也是是需需要要克克隆隆或表达的基因。或表达的基因。基因工程育种基本基因工程育种基本过过程程1 1、获取、获取目的基因来源目的基因来源 1）制制备备基因基因组组DNA 2）制制备备cDNA 3）聚合聚合酶酶链链反反应应 4）人工合成基因人工合成基因
22、二、二、目的基因与目的基因与载载体的体的连连接（接（接接）（主要有以下（主要有以下4种种连连接方式）接方式）1)粘性末端粘性末端连连接接 2）平平头头末端末端连连接接 3）人工接人工接头头法法 4）同源多聚尾同源多聚尾连连接法接法2 2、重组、重组三、重三、重组组DNA导导入宿主入宿主细细胞（胞（转转）重重组组DNA导导入宿主入宿主细细胞的胞的类类型型转转化化 以以质质粒粒作作载载体构建的重体构建的重组组体体导导入受体入受体细细胞的胞的过过程；程；转转染染 以病毒以病毒作作载载体构建的重体构建的重组组体体导导入受体入受体细细胞的胞的过过程；程；转导转导 以以噬菌体噬菌体作作载载体构建的重体构建
23、的重组组体体导导入受体入受体细细胞的胞的过过程程。四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组（筛选含重组DNA的阳性克隆）的阳性克隆）筛选一般有下列几种方法：筛选一般有下列几种方法：1平板筛选平板筛选2限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选3PCR筛选重组体筛选重组体4原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝蓝白白筛选筛选1平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。1）插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。抗生素平板抗生素平板筛选筛选（插入失活插入失活）2）蓝蓝-白斑白斑筛选筛选 它
24、它是是一一种种利利用用蓝蓝色色化化合合物物的的形形成成作作为为指指示示剂剂的的筛筛选选方方法法，筛筛选选含含有有编码编码-半乳糖苷半乳糖苷酶酶的基因。的基因。载载体：体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主：编码编码-半乳糖半乳糖苷酶苷酶N端端序列序列 苷苷酶酶C端端序列序列 互互补补细细菌表达：菌表达：-半乳糖苷半乳糖苷酶酶活性蛋白活性蛋白5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚（X-gal）形成形成蓝蓝色菌落色菌落 当在当在质质粒中插入外源粒中插入外源DNA-半乳糖苷半乳糖苷酶酶的的N端基因失活端基因失活不不能与宿主能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进进行互行互补补产产生生白色菌落白色菌落。（
25、IPTG存在下）存在下）蓝蓝白白筛选筛选示意示意图图2.限制性内切限制性内切酶酶图谱鉴图谱鉴3.PCR筛选筛选重重组组体体 抽提少量重抽提少量重组组DNAPCR扩扩增增电电泳泳鉴鉴定定序列分析。序列分析。4.原位原位杂杂交交五、重五、重组组体在宿主体在宿主细细胞中的表达和胞中的表达和调调控控基因工程的最基因工程的最终终目的是通目的是通过载过载体将外源基因体将外源基因导导入入合适的宿主合适的宿主细细胞中高效表达，胞中高效表达，产产生有重要价生有重要价值值的蛋白的蛋白质产质产品。品。克隆基因的表达有三个条件克隆基因的表达有三个条件 基因的基因的编码编码区不能被插入序列所中断区不能被插入序列所中断;
26、基因基因转录转录要有要有启启动动子子，而启，而启动动子必子必须须能被宿主能被宿主 细细胞的胞的RNA聚合聚合酶酶有效地有效地识别识别;mRNA必必须须相当相当稳稳定，并有效地被翻定，并有效地被翻译译，产产生的外生的外 源蛋白源蛋白质质必必须须不不为为宿主宿主细细胞的蛋白胞的蛋白酶酶所降解所降解。5 5、克隆、克隆第五节 基因工程育种的应用(一一)通过基因工程方法生产药物通过基因工程方法生产药物1治疗用药物治疗用药物主主要要是是活活性性蛋蛋白白质质和和多多肽肽类类药药物物，如如人人干干扰扰素素、人人胰胰岛岛素素、人人白白细细胞胞介介素素、人人生生长长素素、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子、表表皮皮生生长
27、长因因子子、集落刺激因子、血小板生长因子、凝血因子等。集落刺激因子、血小板生长因子、凝血因子等。2疫苗疫苗如如甲甲肝肝疫疫苗苗、乙乙肝肝疫疫苗苗、丙丙肝肝疫疫苗苗、疟疟疾疾疫疫苗苗、伤伤寒寒及及霍霍乱乱疫苗、避孕疫苗等。疫苗、避孕疫苗等。3单克隆抗体及诊断试剂单克隆抗体及诊断试剂如前列腺磷酸酶、如前列腺磷酸酶、T细胞及其亚群、狂犬病毒、风疹病毒、细胞及其亚群、狂犬病毒、风疹病毒、沙眼衣原体、沙眼衣原体、T4、IgE、HCG-、抗肝癌、胃癌、肺癌、白、抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等单克隆抗体及诊断试剂血病等单克隆抗体及诊断试剂基因工程育种的应用基因工程育种的应用(二二)通过基因工程方法提高菌种的生产能力通过基因工程方法提高菌种的生产能力氨氨基基酸酸、抗抗生生素素、酶酶制制剂剂、其其它它次次级级代代谢谢产产物物（乙乙醇醇、氢、甲烷等）氢、甲烷等）(三三)通过基因工程方法改进传统发酵工艺通过基因工程方法改进传统发酵工艺氧气利用氧气利用(四四)通过基因工程方法提高菌种抗性通过基因工程方法提高菌种抗性抗污染、抗毒害、耐高温抗污染、抗毒害、耐高温1、基因工程中的重要、基因工程中的重要酶酶类类有哪些？各起什么有哪些？各起什么作用？作用？2、基因工程、基因工程载载体必体必须须具具备备哪些基本条件？哪些基本条件？3、请简请简述基因工程育种的一般述基因工程育种的一般过过程。程。思考题