《基因工程育种》PPT课件.ppt

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1、第八章第八章基因工程育种基因工程育种1第一节第一节 基因工程育种基因工程育种概述概述第二节第二节 重要的重要的工具酶工具酶第三节第三节 常用的载体常用的载体第四节第四节 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程第五节第五节 基因工程育种的应用基因工程育种的应用主要内容主要内容2第一节 基因工程育种概述3Cohen和和Boyverl973年年首首次次成成功功完完成成了了DNA分分子子的的 体体 外外 重重 组组 实实 验验，宣宣 告告 基基 因因 工工 程程(geneengineering)的的诞诞生生，也也为为微微生生物物育育种种带带来来了了一一场场革命。革命。基因工程育种基因工程育种广义的基

2、因工程育种包括所有利用广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术重组技术将外源基因导入到微生物细胞将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的，使后者获得前者的某些某些优良性状优良性状或者利用后者作为表达场所来或者利用后者作为表达场所来生产目生产目的产物的产物。4基因工程育种的优势基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突破物种间的障碍，破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交实现真正意义上的远缘杂交。而且。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。

3、同时，利用基因工动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工程方法，程方法，人们可以人们可以“随心所欲随心所欲”地进行自然演化过程地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术，是最新、最有前途的育种方法。育种技术，是最新、最有前途的育种方法。5第二节 重要的工具酶6工工具酶具酶 基基因因工工程程中中的的工工具具酶酶主主要要是是指指用用于于DNADNA和和RNARNA分分子子的的切切割割、连连接接、聚聚合合、修修饰饰、反反转转录录

4、等等有有关关的的各各种种酶酶系系统统。7一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(RE)(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，的核酸内切酶，简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类：、和和型，型，其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。8限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的DNADNA片

5、断，主要产生片断，主要产生3 3种缺口：种缺口：55粘性末端粘性末端 33粘性末端粘性末端 平头末端平头末端 回文序列回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180O O旋转对称旋转对称;粘性末端粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的55末端突出或末端突出或33末端突出的碱基序列，相互具有互补性末端突出的碱基序列，相互具有互补性。910其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶11同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的相同的识别序

6、列识别序列。在切割在切割DNADNA时，其时，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，产生平的，产生平头末端，称为头末端，称为同识同切同识同切；切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，产生的，产生3 3或或55粘性末粘性末端，称为端，称为同识异切同识异切。12同裂酶同裂酶同识同识同同切切13同裂酶同裂酶同识同识异异切切14同同尾尾酶酶 同尾酶同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性粘性末端末端。15可变酶可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，识别顺序中的一个或几个

7、碱基是可变的，并且识别顺序往往超过并且识别顺序往往超过6 6个碱基对。个碱基对。如，如，BstBstp p，其识别顺序为其识别顺序为GGTGGTN NACCACC。16 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称酶名称酶名称识别顺序识别顺序同裂酶同裂酶同尾酶同尾酶Bacillus amyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌BamHGGATCCBstBgl MboBacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌Bgl ACATCTEscherichia coliRY13大肠杆菌大肠杆菌EcoRGAATTCHaemophilus influenzae流感嗜血菌流感

8、嗜血菌HindAAGCTTHsuProvidencia stuartii164普罗威登细菌普罗威登细菌PstCTGCAGSalpStreptomyces albusSubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌SalGTCGACAvaXho17二、二、DNADNA聚合酶聚合酶 （最常用的最常用的DNADNA聚合酶有以下聚合酶有以下4 4种种）DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶大片段大片段KlenowKlenow片段片段 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 T T4 4 噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶聚合酶18 DNADNA聚合酶聚合酶 E.ColiE

9、.Coli DNADNA聚合酶聚合酶（DNA DNA polpol ）是一个具有是一个具有3 3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括：包括：5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性19 DNA DNA polpol 应用应用 催化催化DNADNA缺口平移缺口平移反应，制备高比活性反应，制备高比活性DNADNA 探针；探针；第二条第二条cDNAcDNA链的合成；链的合成；对对DNA3DNA3突出末端进行标记；突出末端进行标记；DNADNA序列分析。序列分析。20E.coli DNA pol 催化切

10、口平移21 KlenowKlenow片段（片段（DNA DNA polpol.大片断）大片断）22 KlenowKlenow片段用途片段用途 补齐双链补齐双链DNADNA的的 33末端；末端；用标记碱基补用标记碱基补 齐齐3 3末端末端 ；在在cDNAcDNA克隆中，克隆中，用于第二股链用于第二股链 的合成；的合成；DNADNA序列分析。序列分析。23 TaqTaq DNA DNA polpol（耐热（耐热DNADNA聚合酶）聚合酶）作用作用特点特点1 1）TaqTaq DNA DNA polpol催化催化DNADNA合成的最适温度范围合成的最适温度范围 70 70 7575，2 2）9595

11、以上高温，半小时不失活，以上高温，半小时不失活，3 3）最适合用于聚合酶链反应（最适合用于聚合酶链反应（PCRPCR）。）。24三、逆转录酶三、逆转录酶 特点特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3 3种酶种酶活性：活性：以单链以单链RNA RNA 为模板，为模板，催化合成催化合成cDNAcDNA单链单链 具有具有RNaseRNase H H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA杂交链中的杂交链中的 RNARNA 以以DNADNA为模板，催化合成为模板，催化合成cDNAcDNA双链。双链。25 逆转录酶的应用：逆转录酶的应用：将将mR

12、NAmRNA逆转录成逆转录成cDNAcDNA，构建构建cDNAcDNA文库；文库；补平和标记补平和标记5 5-末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段；代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析；制备杂交探针等。制备杂交探针等。26四、四、DNADNA连接酶连接酶(DNA(DNA ligaseligase)DNADNA连连接接酶酶可可以以 催催化化带带有有粘粘性性末末端端或或平平头头末末端端的的双双链链DNADNA中中一一条条链链的的33OHOH与与另另一一条条链链的的55POPO3 3H H2 2形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键而而相相连连，从从而而构构成成一一

13、条条完完整整的的DNADNA长长链。链。DNADNA连接酶的用途连接酶的用途（1 1）两个双链两个双链DNADNA片段连接起来片段连接起来 5-ACG AATTCGT-3 5-ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA连接酶连接酶 5-ACGAATTCGT-35-ACGAATTCGT-3 3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5 3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5（2 2）修补带有缺口的双链修补带有缺口的双链DNADNA分子分子T4DNA连接酶连接酶27五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP)(BAP)能够催化水解去除

14、能够催化水解去除DNADNA或或RNA5-RNA5-端端的磷酸基团。的磷酸基团。用途用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 55端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。重组效率。用用3232P P标记标记5-5-端前，去除端前，去除5-P5-P，再通过激酶作用再通过激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端进行标记。端进行标记。28六、末端六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶（脱氧核苷酸）转移酶(TdTTdT)作用作用 将将标标记记或或未未标标记记的的dNTPdNTP加加到到DNADNA的的

15、3OH3OH末末端端；也也可可催催化化载载体体分分子子或或待待克克隆隆的的DNADNA片片断断上上加加上上互互补补的的同同聚聚尾尾，便便于于进进一步连接。一步连接。应用应用 探针标记探针标记 P32-.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接29重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5-磷酸与磷酸与3 3-羟基羟基 形成磷酸

16、二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成DNA DNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚体尾端合成同聚体尾30第三节第三节 常用的载体常用的载体31载体载体(vector)(vector)是将外源是将外源DNA(DNA(目的目的DNA)DNA)片断引入宿主细胞片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为的运载工具，其化学本质

17、为DNA DNA。载体必须具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的种类载体的种类 常用的载体常用的载体32一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件 有自身的有自身的复制子复制子，能独立复制，能独立复制 具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点多克隆位点)具有具有遗传表型或遗传表型或筛选筛选标记标记 有有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源DNADNA片段。片段。表达型载体表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的还应具备与宿主细胞相适应的启动启动 子、前导序列、增强子子、前导序列、增强子等调控元件。等调控元件。载体载体DNADNA中均有一段中均有一段非必需区非

18、必需区，将外源基因插入，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。该非必需区，而载体本身不受影响。33二、载体的种类二、载体的种类（一）（一）克隆载体克隆载体 用来克隆和扩增用来克隆和扩增DNADNA片段的载体，具有片段的载体，具有3 3点点共性共性：能够在受体细胞复制；能够在受体细胞复制；带有药物抗性基因，便于筛选；带有药物抗性基因，便于筛选；可导入受体细胞。可导入受体细胞。（二）（二）表达载体表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件件转录和翻译所必须的转录和翻译所必须的DNADNA顺序。顺序。34三、常用的载体三、常用的载体（一

19、）（一）质粒质粒 (plasmid)(plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNADNA分子。分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数有较高的拷贝数 2.2.具有具有1 1个以上的遗传标志，便于筛选个以上的遗传标志，便于筛选 3.3.具有多克隆位点具有多克隆位点 35广泛应用的质粒：广泛应用的质粒：pBR32质粒、质粒、pUC系列等系列等36pBR322pBR322质粒质粒 4363 4363 b

20、pbp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标含一个抗氨卞青霉素标 记记(ampampR R)一个抗四环素标记一个抗四环素标记 (tettetR R)ampampR R和和tettetR R基因内各有基因内各有一些限制酶的酶切位点，一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入供外源基因插入 当外原基因插入抗药当外原基因插入抗药基因位点时，基因位点时，AmpAmpR RAmpAmp敏敏感感(AmpAmpS S)、TetTetR RTetTet敏敏感感(TetTetS S).).37pUC系列质粒系列质粒 由由pBR322pBR322和和M13M13噬噬菌菌体体构构建而成的双链质粒载体；建而成的双链

21、质粒载体；（1 1）2674bp2674bp；（2 2）有有ampampr r和与和与M13M13噬菌体噬菌体 相同的多克隆位点（相同的多克隆位点（MCSMCS）（3 3）有有一一个个来来自自大大肠肠杆杆菌菌的的LacZLacZ操操纵纵子子的的DNADNA片片断断,编编码半乳糖苷酶码半乳糖苷酶38 (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点：双链线状双链线状DNADNA分子，分子，全长全长50kb50kb，含含6565个基因，个基因，在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为COSCOS位点。位点。39 噬菌体感

22、染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（溶菌性生长（lyticlytic pathway pathway）噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，借借助助其其2 2个个COSCOS位位点点互互补补成成环环，在在宿宿主主菌菌体体内内连连续续复复制制，合合成成大大量量基基因因产产物物，进进而而装装配配成成噬噬菌菌体体颗粒，颗粒，裂解宿主菌裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长溶源性生长(lysogeniclysogenic pathway)pathway)噬噬菌菌体体感感染染细细菌菌后后，可可将将自自身身

23、DNADNA整整合合到到细细菌菌的的染染色色体体中中去去，与与之之一一起起复复制制，并并遗遗传传给给子子代代细细胞胞，宿宿主主细细胞胞不不被被裂裂解解 。40 第四节第四节 基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程41 基因工程原理基因工程原理42一、目的基因的获取（一、目的基因的获取（分分）目的基因目的基因 是是指指所所要要研研究究或或应应用用的的基基因因，也也是是需需要要克克隆或表达的基因。隆或表达的基因。基因工程育种基本过程基因工程育种基本过程431 1、获取、获取目的基因来源目的基因来源 1 1）制备基因组制备基因组DNADNA 2 2）制备制备cDNAcDNA 3 3）聚合酶链反应聚

24、合酶链反应 4 4）人工合成基因人工合成基因44 二、二、目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接）（主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式）1)1)粘性末端连接粘性末端连接 2 2）平头末端连接平头末端连接 3 3）人工接头法人工接头法 4 4）同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法452 2、重组、重组46三、重组三、重组DNADNA导入宿主细胞（导入宿主细胞（转转）47重组重组DNADNA导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型转化转化 以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染转染 以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的

25、过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导转导 以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。48四、重组四、重组DNA的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组（筛选含重组DNA的阳性克隆）的阳性克隆）49筛选一般有下列几种方法：筛选一般有下列几种方法：1平板筛选平板筛选2限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选3PCR筛选重组体筛选重组体4原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝白筛选蓝白筛选501平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。1）插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长

26、在含相应抗生素的培养平板上。51 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）522 2）蓝蓝-白斑白斑筛选筛选 它它是是一一种种利利用用蓝蓝色色化化合合物物的的形形成成作作为为指指示示剂剂的的筛筛选选方方法法，筛筛选选含有编码含有编码-半乳糖苷酶的基因。半乳糖苷酶的基因。载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主：编码编码-半乳糖半乳糖苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 互补互补细菌表达：细菌表达：-半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（X-gal）形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源DNA-DN

27、A-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不不能与宿主能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行互补进行互补产生产生白色菌落白色菌落。（IPTG存在下）存在下）53 蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图542.2.限制性内切酶图谱鉴限制性内切酶图谱鉴553.PCR3.PCR筛选重组体筛选重组体 抽提少量重组抽提少量重组DNADNAPCRPCR扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。4.4.原位杂交原位杂交56五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，

28、产生有重要价值的蛋白合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。质产品。克隆基因的表达有三个条件克隆基因的表达有三个条件 基因的基因的编码区不能被插入序列所中断编码区不能被插入序列所中断;基因转录要有基因转录要有启动子启动子，而启动子必须能被宿主，而启动子必须能被宿主 细胞的细胞的RNARNA聚合酶有效地识别聚合酶有效地识别;mRNAmRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。575 5、克隆、克隆58第五节 基因工程育种的应用59(一一)通过基因工程方法生产药物通

29、过基因工程方法生产药物1治疗用药物治疗用药物主主要要是是活活性性蛋蛋白白质质和和多多肽肽类类药药物物，如如人人干干扰扰素素、人人胰胰岛岛素素、人人白白细细胞胞介介素素、人人生生长长素素、肿肿瘤瘤坏坏死死因因子子、表表皮皮生生长长因因子子、集落刺激因子、血小板生长因子、凝血因子等。集落刺激因子、血小板生长因子、凝血因子等。2疫苗疫苗如如甲甲肝肝疫疫苗苗、乙乙肝肝疫疫苗苗、丙丙肝肝疫疫苗苗、疟疟疾疾疫疫苗苗、伤伤寒寒及及霍霍乱乱疫苗、避孕疫苗等。疫苗、避孕疫苗等。3单克隆抗体及诊断试剂单克隆抗体及诊断试剂如前列腺磷酸酶、如前列腺磷酸酶、T细胞及其亚群、狂犬病毒、风疹病毒、细胞及其亚群、狂犬病毒、风

30、疹病毒、沙眼衣原体、沙眼衣原体、T4、IgE、HCG-、抗肝癌、胃癌、肺癌、白抗肝癌、胃癌、肺癌、白血病等单克隆抗体及诊断试剂血病等单克隆抗体及诊断试剂基因工程育种的应用基因工程育种的应用60(二二)通过基因工程方法提高菌种的生产能力通过基因工程方法提高菌种的生产能力氨氨基基酸酸、抗抗生生素素、酶酶制制剂剂、其其它它次次级级代代谢谢产产物物（乙乙醇醇、氢、甲烷等）氢、甲烷等）(三三)通过基因工程方法改进传统发酵工艺通过基因工程方法改进传统发酵工艺氧气利用氧气利用(四四)通过基因工程方法提高菌种抗性通过基因工程方法提高菌种抗性抗污染、抗毒害、耐高温抗污染、抗毒害、耐高温611 1、基因工程中的重要酶类有哪些？各起什么、基因工程中的重要酶类有哪些？各起什么作用？作用？2 2、基因工程载体必须具备哪些基本条件？、基因工程载体必须具备哪些基本条件？3 3、请简述基因工程育种的一般过程。、请简述基因工程育种的一般过程。思考题62