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1、 高考揭秘高考揭秘 从从3 3年高考试题来看，高考年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景还需多做新情景，将会收，将会收到良好的效果。到良好的效果。PCRPCR为目的基因
2、提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理 基因工程难度大，需要多练基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测限制酶选择，正反接检测和和基因编辑基因编辑等情景等情景 微生物的选择和鉴别是核心考点微生物的选择和鉴别是核心考点，结合，结合基因工程改造基因工程改造近几年命题趋势近几年命题趋势 细胞工程和胚胎工程细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察：常以中国最新的技术为背景考察。热点考察：热点考察：新冠检测相关技术新冠检测相关技术，酵母双杂酵母双杂等复杂等复杂情景情景(题目主要来源：题目主要来源：2019-20222019-202
3、2年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题第第2 2讲：基因工程的高频考点与情景讲：基因工程的高频考点与情景考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容考法考法2 2 限制酶的选择限制酶的选择 （高频）（高频）考法考法3 3 正反接的检测方式（难点）正反接的检测方式（难点）考法考法4 4 基因编辑（反义基因、课本基因编辑（反义基因、课本CRISRP/Cas9CRISRP/Cas9）专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题1.1.基因工程中
4、的基因工程中的4 4个个“3 3”基因工程的基因工程的3 3种基本工具种基本工具 限制酶：限制酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNADNA分子。分子。注意：注意：不是只识别一种序列，有些可以识别摇摆的序列不是只识别一种序列，有些可以识别摇摆的序列 DNADNA连接酶：连接酶：E EcolicoliDNADNA连接酶只能连接连接酶只能连接黏性末端黏性末端；T T4 4DNADNA连接酶能连接连接酶能连接黏性末端和平末端黏性末端和平末端。载体：需具备的条件包括：载体：需具备的条件包括：a.a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制。能在宿主细胞内稳定存在并
5、大量复制。b.b.有一个至多个限制酶切割位点。有一个至多个限制酶切割位点。c.c.具有标记基因，以便对目的基因进行检测。具有标记基因，以便对目的基因进行检测。（注意条件和作用得区分）（注意条件和作用得区分）考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容1.1.基因工程中的基因工程中的4 4个个“3 3”获取目的基因的获取目的基因的3 3条途径条途径 从从基因文库基因文库中获取：中获取：基因组文库：包含某生物的全部基因片段基因组文库：包含某生物的全部基因片段cDNAcDNA文库：不含启动子，终止子和内含子，方便进行基因工程的基因交流文库：不含启动子，终止子和内含子，方便进行基因工程的基因交
6、流 利用利用PCRPCR技术技术扩增；扩增；用用化学方法直接人工合成化学方法直接人工合成：常用常用mRNAmRNA逆转录现成逆转录现成cDNAcDNA考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容1.1.基因工程中的基因工程中的4 4个个“3 3”将目的基因导入受体细胞的将目的基因导入受体细胞的3 3种类型种类型植物：植物：体细胞或受精卵体细胞或受精卵常用常用农杆菌转化法农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法、基因枪法花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物，老教材单子叶植物，老教材)。动物：动物：受精卵受精卵显微注射技术显微注射技术。微生物：微生物：常用大肠杆
7、菌常用大肠杆菌钙离子处理法（严格按课本填，不要写感受态细胞法）钙离子处理法（严格按课本填，不要写感受态细胞法）。考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容1.1.基因工程中的基因工程中的4 4个个“3 3”目的基因分子水平检测的目的基因分子水平检测的3 3个层次个层次 检测目的基因是否插入到转基因生物的检测目的基因是否插入到转基因生物的DNADNA上：上：PCRPCR或或DNADNA分子杂交技术（两个都答）分子杂交技术（两个都答）。检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA：PCRPCR或或分子杂交技术分子杂交技术。检测目的基因是否翻译成蛋白质：检测目的基因是否
8、翻译成蛋白质：抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术。如果问的是如果问的是原理原理：抗原和抗体可以特异性结合抗原和抗体可以特异性结合考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容20202020山山东东省省高高三三期期末末节节选选 血血管管内内皮皮生生长长因因子子(VEGF)(VEGF)是是在在肿肿瘤瘤细细胞胞中中通通过过表表达达，分分泌泌到到血血液液中中的的蛋蛋白白类类生生长长因因子子，促促进进肿肿瘤瘤血血管管的的生生成成，进进而而为为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。研研究究人人员员利利用用pVAX1pVAX1质质粒粒和和VEGFVEGF基基因因构
9、构建建了了pVAX1VEGFpVAX1VEGF的的DNADNA疫疫苗苗，为为肿肿瘤瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：免疫治疗奠定基础。回答下列问题：1)1)首首先先从从人人的的肺肺癌癌细细胞胞株株A549A549中中提提取取mRNAmRNA，通通过过_法法获获得得VEGFVEGF基基因。因。3)3)构构建建的的pVAX1VEGFpVAX1VEGF上上应应含含有有特特定定的的_(_(填填“复复制制原原点点”“”“启启动动子子”或或“标标记记基基因因”)，它它能能被被受受体体细细胞胞的的_所所识识别别，以以便便于于催催化转录过程。化转录过程。4)DNA4)DNA疫疫苗苗制制备备简简单单，价价格格低
10、低廉廉，且且免免疫疫强强度度高高，应应答答持持久久，但但同同时时也也可可能能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是是_。反转录反转录启动子启动子RNARNA聚合酶聚合酶DNADNA疫苗疫苗注入体内后，可能整合到宿主基因组上，导致细胞发生变异，使细注入体内后，可能整合到宿主基因组上，导致细胞发生变异，使细胞功能异常胞功能异常2.(20202.(2020河河北北省省邯邯郸郸一一中中高高三三月月考考)基基因因工工程程载载体体是是DNADNA重重组组技技术术使使用用的的基基本工具。回答下列问题：本工具。回答下列问题：1 1)大大肠肠杆杆菌
11、菌的的质质粒粒常常被被用用来来做做基基因因工工程程中中的的载载体体，其其主主要要优优点点 是是_ _ _ _ _ _ _ _ _ _(_(至至 少少 两两项项)。基基 因因 工工 程程 中中 常常 使使 用用 的的 载载 体体 除除 质质 粒粒 外外，还还 有有_(至少两项至少两项)。2)2)在在进进行行基基因因工工程程操操作作中中，真真正正被被用用作作载载体体的的质质粒粒都都是是在在天天然然质质粒粒的的基基础础上上进进行行人人工工改改造造过过的的。在在构构建建基基因因表表达达载载体体时时，通通过过人人工工改改造造，基基因因表表达达载载体体中中除除了了含含有有目目的的基基因因外外，还还必必须须
12、有有_等等。构构建建目目的的基基因因表表达达载载体体的的目目的的一一方方面面是是使使目目的的基基因因在在受受体体细细胞胞中中_，并并遗遗传传给给下下一一代代；另另一一方方面面，使目的基因能够使目的基因能够_，从而得到转基因产品或生物。从而得到转基因产品或生物。能能自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点自主复制，有标记基因，有一个至多个酶切位点噬菌体、动植物病毒噬菌体、动植物病毒启动子、终止子和标记基因启动子、终止子和标记基因稳定存在稳定存在表达并发挥作用表达并发挥作用2.2.基因工程的核心步骤：基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 基因表达载体的组成：基因表达载体启动子
13、目的基因终止子标基因表达载体的组成：基因表达载体启动子目的基因终止子标记基因复制原点记基因复制原点目的基因插入目的基因插入启动子下游，终止子上游启动子下游，终止子上游 基本基本构建过程：构建过程：我们会更加倾向于选择双酶切，我们会更加倾向于选择双酶切，因为可以避免因为可以避免质粒和目的基因的自生环化以及质粒和目的基因的自生环化以及反向连接。反向连接。考法考法1 1 基因工程的基因工程的核心内容核心内容2.2.基因工程的核心步骤：基因工程的核心步骤：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 启动子具有物种特异性和组织特异性启动子具有物种特异性和组织特异性 例如例如用乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候用
14、乳腺生物反应器生产药用蛋白的时候药用蛋白基因连接在药用蛋白基因连接在乳腺蛋白基因的启动子乳腺蛋白基因的启动子后面后面 枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由枯草芽孢杆菌分泌可降解纤维素的一种酶，这种酶由W W基因编码。为在基因编码。为在乳酸杆菌中表达乳酸杆菌中表达W W基因，在构建基因表达载体时，基因，在构建基因表达载体时，W W基因上游启动子应选择基因上游启动子应选择_（填写字母）。（填写字母）。A A枯草芽孢杆菌启动子枯草芽孢杆菌启动子BB乳酸杆菌启动子乳酸杆菌启动子CC农杆菌启动子农杆菌启动子让W基因在乳酸杆菌中成功表达，所以应当选择乳酸杆菌启动子。B B考法考法1 1 基因工程
15、的基因工程的核心内容核心内容 典例典例 研究人员利用生物工程技术，探究猪研究人员利用生物工程技术，探究猪bmp15bmp15基因在不同组织细胞中的基因在不同组织细胞中的特异性表达。该工程技术基本流程如下图特异性表达。该工程技术基本流程如下图(EGFP(EGFP基因控制合成增强型绿色荧基因控制合成增强型绿色荧光蛋白；过程光蛋白；过程表示表达载体表示表达载体2 2成功导入各组织细胞成功导入各组织细胞)。请回答：。请回答：1 1）过程）过程中，需利用中，需利用_限制酶处理表达载体限制酶处理表达载体1 1。2 2）过程）过程中，常采用中，常采用_技术将表达载体技术将表达载体2 2成功导入受体细胞。成功
16、导入受体细胞。XhoXho和和HindHind 显微注射显微注射3 3）在实验结果的基础上，提取上述猪肌肉细胞的）在实验结果的基础上，提取上述猪肌肉细胞的_(_(填填“mRNA”“mRNA”或或“DNA”)“DNA”)，利用标记的，利用标记的_作探针，进行分子杂交，可进一步探究作探针，进行分子杂交，可进一步探究猪猪bmp15bmp15基因特异性表达的原因。基因特异性表达的原因。4 4）实验结果表面，猪）实验结果表面，猪bmp15bmp15基因在基因在_细胞特异性表达。细胞特异性表达。猪卵巢猪卵巢mRNAmRNAEGFPEGFP基因基因 1.1.限制酶选择的基本方法限制酶选择的基本方法 选选择择
17、的的限限制制酶酶的的切切点点不不能能位位于于目目的的基基因因内内部部，所所以以上上述述不不能能选选择择_答案：答案：SmaSma 当当标标记记基基因因唯唯一一时时，也也不不能能位位于于标标记记基基因因内内部部，否否则则会会破破坏坏目目的的基基因因或标记基因，上图中不能选择或标记基因，上图中不能选择_。答案：答案：SmaSma考法考法2 2 限制酶的选择限制酶的选择 （高频）（高频）1.1.限制酶选择的基本方法限制酶选择的基本方法 应应选选择择切切点点位位于于目目的的基基因因两两端端的的限限制制酶酶，同同时时质质粒粒上上也也有有其其切切点点，如如上上图图中可选择中可选择_。答案：答案：PstPs
18、t 为为避避免免目目的的基基因因和和质质粒粒的的自自身身环环化化和和随随意意连连接接，也也可可使使用用不不同同的的限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质质粒粒，如如上上图图也也可可选选择择用用_两两种种限制酶。限制酶。答案：答案：PstPst和和EcoREcoR考法考法2 2 限制酶的选择限制酶的选择 （高频）（高频）20232023广东校联考广东校联考 为使目的基因与载体正确连接，为使目的基因与载体正确连接，在设计在设计 PCR PCR 引物时可引物时可添加限制酶添加限制酶 _ _的识别序列。的识别序列。XhoXho和和MunMun 考察排除法：因为使用考察排除法：因为使用S S和和N
19、N会破坏目的基因，使用会破坏目的基因，使用E E会导会导致致重组质重组质粒两个标记基因都被破坏粒两个标记基因都被破坏2.2.同种酶和同尾酶同种酶和同尾酶 及及重点题型分析重点题型分析限制酶限制酶 BamHIBamHI BglBgl HindHind XbaIXbaI识别序列和切识别序列和切割位点割位点GGATCCGGATCCAGATCTAGATCTAAGCTTAAGCTTTCTAGATCTAGA过程过程需要的限制酶是需要的限制酶是_质粒质粒需要的限制酶是需要的限制酶是_提示：双标记基因得切除一个提示：双标记基因得切除一个考法考法2 2 限制酶的选择限制酶的选择 （高频）（高频）上一页的题目继续
20、节选上一页的题目继续节选 研究发现人溶菌酶（研究发现人溶菌酶（hLZhLZ）是天然抗生素替代品。）是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶（从乳汁中提取）。过程如图所示。其中编号取）。过程如图所示。其中编号 表示过程表示过程;质粒质粒S S中的基因中的基因LenLen通过控通过控制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必制相关酶的合成而控制亮氨酸的合成（亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸），基因不可少的一种必需氨基酸），基因GFPGFP控制合成绿色荧光蛋白。四
21、种限制性控制合成绿色荧光蛋白。四种限制性核酸内切酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：核酸内切酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题：2 2）为成功筛选出含重组质粒）为成功筛选出含重组质粒T T的成纤维细胞。质粒的成纤维细胞。质粒S S中用作标记基因的是中用作标记基因的是_。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是。为达到筛选目的，培养基的营养成分中特殊之处是_。若用。若用PCRPCR检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实检测目的基因是否成功导入受体细胞中，实验组以待测的样本验组以待测的样本DNADNA为模板，使用目的基因的特异性引物进行为模板，使用目的基因的特异性引物进行P
22、CRPCR扩增，扩增，同时将以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，将以同时将以目的基因片段为模板的组别作为阳性对照组，将以_为模板的组别作为阴性对为模板的组别作为阴性对照组。照组。非目的基因片段或非目的基因片段或S S质粒质粒基因基因LeuLeu、基因、基因GFPGFP(就算要被目的基因切除也算标记基因就算要被目的基因切除也算标记基因)不含有亮氨酸不含有亮氨酸20222022湖北节选湖北节选 提取品系乙的提取品系乙的mRNAmRNA，通过基因重组技术，以，通过基因重组技术，以TiTi质粒为表质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培有出转S
23、S基因的新品系。基因的新品系。3 3）如图是）如图是S S基因的基因的cDNAcDNA和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）和载体的限制性内切核酸酶（限制性核酸内切酶）酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用最好选用_酶切割酶切割S S基因的基因的cDNAcDNA和载体。和载体。XbaXba、HindHind 考法考法3 3 正反接的检测（难点，需要绘图）正反接的检测（难点，需要绘图）补充知识点补充知识点 即便我在质粒插入了目的基因，但是有时候可能根本无法表即便我在质粒插入了目的基因，但是有时
24、候可能根本无法表达，常见原因分析：达，常见原因分析：目的基因不能正常表达（转录和翻译过程受阻）；目的基因不能正常表达（转录和翻译过程受阻）；目的基因反向连接目的基因反向连接1.1.利用电泳进行检测利用电泳进行检测2.2.利用利用PCRPCR进行检测进行检测后续如有其他方式再补充后续如有其他方式再补充20222022广东高三统考节选广东高三统考节选 某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导某科研团队利用农杆菌转化法将抗除草剂基因导入甘蓝，过程如图入甘蓝，过程如图1 1所示，所示，为操作步骤，限制酶为操作步骤，限制酶BamBamHIHI、BglBgl、EcoEcoRIRI酶切位点唯一，酶切位点唯
25、一，BamBamHIHI和和EcoEcoRIRI之间的距离为之间的距离为20kb20kb，BamBamHIHI和和BglBgl之间距离之间距离为为25kb,25kb,识别序列和切割位点如表识别序列和切割位点如表4 4所示。请回答：所示。请回答：限制酶识别序列和切割位点限制酶识别序列和切割位点Bam HIBam HI G GATCCG GATCCBglBgl A GATCTA GATCTEcoRIEcoRI GG AATTCAATTC1.1.使用电泳进行检测使用电泳进行检测考法考法3 3 正反接的检测（难点，需要绘图）正反接的检测（难点，需要绘图）2 2）目的基因用目的基因用BamBamHIHI
26、和和BglBgl剪切，质粒用剪切，质粒用BamBamHIHI剪切，剪切后的目的基因剪切，剪切后的目的基因和质粒能连接在一起，原因是和质粒能连接在一起，原因是_。酶切后的目的基因存在正。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用向与反向两种连接方式，可用 _ _酶对两种重组质粒进酶对两种重组质粒进行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如图行剪切，通过凝胶电泳分析产物大小进行区分，如图2 2所示，图中所示，图中 (填填“样品样品1”1”或或“样品样品2”)2”)为所需基因表达载体。为所需基因表达载体。切割切割DNADNA后产生相同的黏性末端后产生相同的黏性末端BamH IBamH I和和
27、EcoR I EcoR I 样品样品2 2限制酶识别序列和切割位点限制酶识别序列和切割位点Bam HIBam HI G GATCCG GATCCBglBgl A GATCTA GATCTEcoRIEcoRI GAATTCGAATTC 难点分析：难点分析：笔记：同尾酶的酶切切位可以连接，笔记：同尾酶的酶切切位可以连接，但是连接后，不能再被这两种酶识别但是连接后，不能再被这两种酶识别4 4）易错题：易错题：步骤步骤将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在步骤的培养基中添加的培养基中添加_以便筛选岀含目的基因的甘蓝植株。以便筛选岀含目的基因的甘蓝植株。答案是潮霉素，答
28、案是潮霉素，因为只有因为只有TDNATDNA中的基因会到整合到植物当中！中的基因会到整合到植物当中！限制酶识别序列和切割位点限制酶识别序列和切割位点Bam HIBam HI G GATCCG GATCCBglBgl A GATCTA GATCTEcoRIEcoRI GAATTCGAATTC20192019江江苏苏 图图1 1是是某某基基因因工工程程中中构构建建重重组组质质粒粒的的过过程程示示意意图图，载载体体质质粒粒P0P0具具有有四四环环素素抗抗性性基基因因(tettetr r)和和氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因(ampampr r)。请请回回答答下列问题：下列问题：1)1)EcoEc
29、oR R 酶酶切切位位点点为为 ，EcoEcoR R 酶酶切切出出来来的的线性载体线性载体P1P1为为_末端。末端。平平2 2)用用T Ta aq q酶酶进进行行 P PC CR R 扩扩增增获获得得的的目目的的基基因因片片段段，其其两两端端各各自自带带有有一一个个腺腺嘌嘌呤呤脱脱氧氧核核苷苷酸酸。载载体体 P P1 1用用酶酶处处理理，在在两两端端 各各添添加加了了一一个个碱碱基基 为为_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _的的脱脱氧氧核核苷苷酸酸，形形成成P2P2；P2P2和和目目的的基基因因片片段段在在_酶酶作作用用下下，形成重组质粒形成重组质粒P3P3。胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)(T)
30、DNADNA连接连接2.2.利用利用PCRPCR进行检测进行检测考法考法3 3 正反接的检测（难点，需要绘图）正反接的检测（难点，需要绘图）3)3)为筛选出含有重组质粒为筛选出含有重组质粒P3P3的菌落，的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到得到A A、B B、C C三类菌落，其生长情况三类菌落，其生长情况如表如表(“”代表生长，代表生长，“”代表代表不生长不生长)。根据表中结果判断，应选。根据表中结果判断，应选择的菌落是择的菌落是_(_(填表中字母填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别类，另外两类菌落质粒导入情况分别是是_、_。菌落类型菌落类型
31、平板类型平板类型A AB BC C无抗生素无抗生素氨苄青霉素氨苄青霉素四环素四环素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素B BA A类类菌菌落落含有含有P0P0C C类菌落未转入质粒类菌落未转入质粒4)4)为为鉴鉴定定筛筛选选出出的的菌菌落落中中是是否否含含有有正正确确插插入入目目的的基基因因的的重重组组质质粒粒，拟拟设设计计引引物物进进行行PCRPCR鉴鉴定定。图图2 2所所示示为为甲甲、乙乙、丙丙3 3条条引引物物在在正正确确重重组组质质粒粒中中的的相相应应位位置置，PCRPCR鉴鉴定定时时应应选选择择的的一一对对引引物物是是_。某某学学生生尝尝试试用用图图中中另另外外一一对对引引物物从从某某一
32、一菌菌落落的的质质粒粒中中扩扩增增出出了了400 400 bpbp片段，原因片段，原因是是_。乙、丙乙、丙目的基因反向连接目的基因反向连接1.1.反义基因反义基因：是指一段与是指一段与mRNAmRNA或或DNADNA特异性结合并阻断其基因表达的人工特异性结合并阻断其基因表达的人工合成的合成的DNADNA分子分子2.2.双链双链RNARNA：类似前者，在同个基因内部插入反序列导致：类似前者，在同个基因内部插入反序列导致mRNAmRNA形成形成发卡发卡3.CRISRP/Cas93.CRISRP/Cas9：课本出现两处：课本出现两处考法考法4 4 基因组编辑（基因敲除或抑制）基因组编辑（基因敲除或抑
33、制）1.1.反义基因：注意构建的目的基因与需要抑制的基因序列相反反义基因：注意构建的目的基因与需要抑制的基因序列相反20232023陕西一模，结合了上一讲为目的基因添加酶切位点和本节反义基因陕西一模，结合了上一讲为目的基因添加酶切位点和本节反义基因 维生素维生素A A在体内转化为在体内转化为11-11-顺式视黄醛后，与视网膜特定细胞中的视蛋白结顺式视黄醛后，与视网膜特定细胞中的视蛋白结合成视紫红质。视紫红质接受光信号后，合成视紫红质。视紫红质接受光信号后，11-11-顺式视黄醛转变为全反式视黄顺式视黄醛转变为全反式视黄醛，视紫红质构象发生变化，激活细胞内的信号通路，最终产生视觉。全醛，视紫红质
34、构象发生变化，激活细胞内的信号通路，最终产生视觉。全反式视黄醛与视蛋白脱离，经复杂的转运和酶促反应，再度转变为反式视黄醛与视蛋白脱离，经复杂的转运和酶促反应，再度转变为11-11-顺式顺式视黄醛而被重复利用。最新研究表明，一种视黄醛而被重复利用。最新研究表明，一种G G蛋白偶联受体蛋白偶联受体RGRRGR可能参与了可能参与了视觉产生的某些过程。为研究视觉产生的某些过程。为研究RGRRGR的作用机理，某研究小组利用基因工程培的作用机理，某研究小组利用基因工程培育出含育出含RGRRGR反义基因（反义基因是通过原基因反向连接在载体的启动子和终反义基因（反义基因是通过原基因反向连接在载体的启动子和终止
35、子之间，其转录出的止子之间，其转录出的mRNAmRNA与原基因转录出的与原基因转录出的mRNAmRNA互补配对）的转基因小互补配对）的转基因小鼠（鼠（rgrrgr），研究该基因的功能。回答下列问题：），研究该基因的功能。回答下列问题：考法考法4 4 基因组编辑（基因敲除或抑制）基因组编辑（基因敲除或抑制）1)1)为构建为构建RGRRGR反义基因重组载体，需先设计引物，通过反义基因重组载体，需先设计引物，通过PCRPCR技术特异性扩增技术特异性扩增RGRRGR反义基因。为使反义基因。为使PCRPCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列
36、，即在引物酶识别序列，即在引物A A的的_（填（填“3“3端端”或或“5“5端端”）添加）添加_限制酶识别序列，在引物限制酶识别序列，在引物B B添加添加_限制酶识别序列。限制酶识别序列。2)2)培养转基因小鼠过程中，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是培养转基因小鼠过程中，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是_，常用的受体细胞是，常用的受体细胞是_，选择培养基中除有动，选择培养基中除有动物细胞培养的必需成分，还需要添加物细胞培养的必需成分，还需要添加_起筛选作用。起筛选作用。EcoREcoRBamHBamH55端端 显微注射法显微注射法受精卵受精卵四环素四环素解释：利用基因工程构建RGR
37、反义基因表达载体时，需要将目的基因RGR反向连接在基因表达载体上，因此在引物A添加BamH限制酶识别序列，在引物B添加EcoR限制酶识别序列。3)3)研究人员将正常小鼠（研究人员将正常小鼠（WTWT）和转基因小鼠（）和转基因小鼠（rgrrgr）都平均分成两组，一）都平均分成两组，一组在黑暗中饲养组在黑暗中饲养12h12h，另一组在光照下饲养，另一组在光照下饲养12h12h；随后测定小鼠眼睛中；随后测定小鼠眼睛中11-11-顺顺式视黄醛、全反式视黄醛和视紫红质的含量，结果如图所示。式视黄醛、全反式视黄醛和视紫红质的含量，结果如图所示。据图分析，光照条件下据图分析，光照条件下RGRRGR的作用机理
38、可能是的作用机理可能是_。RGRRGR通过促进全反式视黄醛转化为通过促进全反式视黄醛转化为11-11-顺式视黄醛，顺式视黄醛，进而增加视紫红质的形成进而增加视紫红质的形成 20222022年广东校联考年广东校联考 杨树生长速度快、木材优质，是优良的纸浆原材料。杨树生长速度快、木材优质，是优良的纸浆原材料。木质素是植物体中总量仅次于纤维素的有机物，其含量影响纸浆质量。在木质素是植物体中总量仅次于纤维素的有机物，其含量影响纸浆质量。在制浆造纸工艺中，需要投入大量的化学药品脱出木质素，且产生大量污染制浆造纸工艺中，需要投入大量的化学药品脱出木质素，且产生大量污染环境的废液。采用基因工程技术调控木质素
39、的生物合成，培育低木质素含环境的废液。采用基因工程技术调控木质素的生物合成，培育低木质素含量的植物新品种，对造纸、纺织和饲草等原料的生产具有重要意义。己知量的植物新品种，对造纸、纺织和饲草等原料的生产具有重要意义。己知木质的合成途径中，肉桂酰辅酶木质的合成途径中，肉桂酰辅酶A A还原酶还原酶(CCR)(CCR)具有重要作用。研究人员利具有重要作用。研究人员利用基因工程技术降低用基因工程技术降低CCRCCR的活性培育低木质素杨树新品种。回答下列问题的活性培育低木质素杨树新品种。回答下列问题:1 1）从新鲜幼嫩叶片提取基因组）从新鲜幼嫩叶片提取基因组DNADNA，获得，获得CCRCCR基因。获取基
40、因后利用基因。获取基因后利用PCRPCR技技术进行扩增，设置扩增条件均为：术进行扩增，设置扩增条件均为：94C 94C预处理预处理5min5min；94C94C 30s30s，55C55C 30s30s，72C 72C 30s30s，共，共3535个循环。其中个循环。其中94C94C、5555处理目的分别是处理目的分别是 _ _ 、。使目的基因解聚为单链使目的基因解聚为单链(1(1分分)1.1.反义基因：反义基因：考法考法4 4 基因组编辑（基因敲除或抑制）基因组编辑（基因敲除或抑制）使引物与模板链结合使引物与模板链结合(1(1分分)2 2）CCRCCR基因连接到基因连接到pUCCRNAipU
41、CCRNAi质粒后质粒后,重组重组pUCCRNAipUCCRNAi质粒换用其他两种质粒换用其他两种_ 酶进行酶切，使酶进行酶切，使CCRCCR基因与基因与pUCCRNAipUCCRNAi质粒进行反向连质粒进行反向连接，得到重组表达载体。接，得到重组表达载体。CCRCCR基因、重组表达载体的结构如下图所示，基因、重组表达载体的结构如下图所示，ad ad 表示表示CCRCCR基因的基因的4 4个位点。个位点。CCRCCR基因重组表达载体将基因重组表达载体将CCRCCR基因的基因的_ 位位点连接到重组表达载体模板链点连接到重组表达载体模板链33处，则重组表达载体转录产生的处，则重组表达载体转录产生的
42、mRNAmRNA可以减可以减少少CCRCCR的合成，理由是的合成，理由是_ _。3 3）重组表达载体先导入）重组表达载体先导入 细胞中再对杨树细胞进行细胞中再对杨树细胞进行转化。若从个体水平对转基因杨树进行鉴定，可检测其转化。若从个体水平对转基因杨树进行鉴定，可检测其 。限制限制(1(1分分)b(1b(1分分)目的基因转录产生的目的基因转录产生的mRNAmRNA与与CCRCCR基因转录产生的基因转录产生的mRNAmRNA发生碱基互补配对，发生碱基互补配对，形成双链结构，从而抑制形成双链结构，从而抑制mRNAmRNA翻译产生翻译产生CCR(4CCR(4分分)农杆菌农杆菌(1(1分分)CCRCCR
43、含量、木质素含量含量、木质素含量(2(2分分)20212021辽宁锦州统考一模节选辽宁锦州统考一模节选 番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合番茄红素具有一定的抗癌效果。普通番茄合成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化作用下转化。科学家利用基因工成的番茄红素易在番茄红素环化酶的催化作用下转化。科学家利用基因工程设计的重组程设计的重组DNADNA（质粒三）能表达出双链（质粒三）能表达出双链RNARNA（发卡），（发卡），番茄细胞可识别番茄细胞可识别双链双链RNARNA并将该双链并将该双链RNARNA和具有相同序列的单链和具有相同序列的单链RNARNA一起降解，从而阻止番茄一起降解，从而阻止番茄红素
44、的转化，红素的转化，提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重提高番茄红素的产量。下图为利用质粒一和目的基因构建重组质粒三的过程示意图。请回答下列问题：组质粒三的过程示意图。请回答下列问题：2.2.双链双链RNARNA：在同个基：在同个基因内部插入反序列导致因内部插入反序列导致mRNAmRNA形成形成发卡发卡考法考法4 4 基因组编辑（基因敲除或抑制）基因组编辑（基因敲除或抑制）1 1）该基因工程中，）该基因工程中，“目的基因目的基因”是是_基因，要想对该基因，要想对该目的基因进行体外扩增，可从番茄组织中提取目的基因进行体外扩增，可从番茄组织中提取mRNAmRNA，通过逆转录获得，通
45、过逆转录获得_用于用于PCRPCR扩增。扩增。PCRPCR扩增目的基因，需要设计相应的引物，设计扩增目的基因，需要设计相应的引物，设计引物时要避免引物之间出现引物时要避免引物之间出现_。碱基互补配对碱基互补配对番茄红素环化酶番茄红素环化酶 cDNA cDNA2 2）PCRPCR扩增时，扩增时，DNADNA先在高温下先在高温下_键断裂，双链解链，然后在温度缓慢键断裂，双链解链，然后在温度缓慢下降的过程中，引物与解开的链结合，这个过程叫做退火。退火温度的设定下降的过程中，引物与解开的链结合，这个过程叫做退火。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物与引物长度
46、、碱基组成有关。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从温度从5555到到7070。长度相同但。长度相同但_的引物需要设定更高的的引物需要设定更高的退火温度。退火温度。氢氢GCGC含量高含量高3 3）“质粒二质粒二”利用利用_开环。为了防止其自身环化，要去除开开环。为了防止其自身环化，要去除开环的质粒两端的环的质粒两端的_个磷酸基团。个磷酸基团。4 4）构建质粒三时，最好在目的基因）构建质粒三时，最好在目的基因A A、B B两端分别加两端分别加_识别序列，目
47、的是识别序列，目的是_。5 5）对于培育成功的转基因番茄植株，）对于培育成功的转基因番茄植株，“发卡发卡”在细胞内可以阻止在细胞内可以阻止_过过程，从而使番茄红素环化酶基因程，从而使番茄红素环化酶基因“沉默沉默”。翻译翻译BamHBamH酶酶EclEcl酶、酶、BamHBamH酶酶确保目的基因反向连接确保目的基因反向连接2 23.CRISRP/Cas93.CRISRP/Cas9CRISPR CRISPR 相关基因位于细菌中。当外源相关基因位于细菌中。当外源 DNA DNA 入侵细菌时，细菌将其作为新的入侵细菌时，细菌将其作为新的“间隔序列间隔序列”整合到自己的基因组中，从而使整合到自己的基因组
48、中，从而使 CRISPR CRISPR 相关基因能相关基因能“记住记住 攻击过自己的外源基因攻击过自己的外源基因。当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和。当再次遇到该外源基因时能对其进行识别、定位和剪切，以达到保护自身的目的。剪切，以达到保护自身的目的。其中其中 crRNA crRNA为为 CRISPR CRISPR 相关基因的转录产物，相关基因的转录产物，其与其与 Cas Cas 酶结合就能起到基因剪辑的作用。酶结合就能起到基因剪辑的作用。20212021海南海南 CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，是一种高效的基因编辑技术，Cas9Cas9基因表达的
49、基因表达的Cas9Cas9蛋白像一把蛋白像一把“分子剪刀分子剪刀”，在单链向导，在单链向导RNARNA（SgRNASgRNA）引导下，切割）引导下，切割DNADNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原基因编辑技术的工作原理如图所示。理如图所示。1 1）过程）过程中，为构建中，为构建CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定重组质粒，需对含有特定sgRNAsgRNA编码序列的编码序列的DNADNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需进行酶切处理，然后
50、将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是要的酶是_。2 2）过程）过程中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_。3 3）过程）过程中，中，SgRNASgRNA与与Cas9Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNASgRNA可识别可识别并与目标并与目标DNADNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是碱基互补配对碱基互补配对。随后，。随后，Cas9Cas9蛋白可切割蛋白可切割_序列。序列。DNADNA连接酶连接酶 钙离子处理法钙离子处理法 目标目标DNADNA特定的核苷酸序列