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1、第37讲 基因工程和生物技术的安全性与伦理问题考点一重组DNA技术的基本工具【知识框架知识框架】指指按按照照人人们们的的愿愿望望,进进行行严严格格的的设设计计并并通通过过转转基基因因等等技技术术，赋赋予予生生物物以以新新的的遗遗传传特特性性,创创造造出出更更符符合合人人们们需需要要的的新新的的生生物物类类型型和和生生物物产产品品。由由于于基基因因工工程程是是在在DNADNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计和和施施工的工的，因此又叫作，因此又叫作DNADNA重组技术。重组技术。【归纳定义】【归纳定义】工程工程别名：别名：操作对象：操作对象：操作水平：操作水平：工程工程实质：实质：什么是基因工
2、程？什么是基因工程？P67P67DNADNA重组技术重组技术基因基因DNADNA分子水平分子水平基因重组基因重组培育抗病毒番木瓜需要用到哪些分子工具？培育抗病毒番木瓜需要用到哪些分子工具？“分子手术刀分子手术刀”准确切割准确切割DNADNA分子分子“分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车”将将DNADNA片段片段连接起来连接起来将体外重组好的将体外重组好的DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞首先要在体外对含有所需要的首先要在体外对含有所需要的DNADNA分子进行分子进行“切割切割”、改造和、改造和“拼接拼接”；然后，将重组然后，将重组DNADNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细
3、胞中表达。分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。1限制性内切核酸酶(限制酶)“分子手术刀”原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端考点一考点一重重组DNA技技术的基本工具的基本工具注意：限制酶不能识别注意：限制酶不能识别RNARNA分子分子写出下列限制酶切割形成的黏性末端写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamBamH:H:EcoEcoR:R:HinHind d :BgBgl:l:GATCGATCAATTAATTAGCTAGCTGATCGATC*思考：你从中发现什么现象了？思考：你从中发现什么现象了？不同的限制酶不同的限制酶可能切割可能切割形成形成相同的黏性末端相同的黏性末端。一、限制
4、性内切核酸酶一、限制性内切核酸酶 分子手术刀分子手术刀2DNA连接酶“分子缝合针”磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端分子缝合针考点一考点一重重组DNA技技术的基本工具的基本工具1.(生命观念生命观念)与与DNA有关的四种酶有关的四种酶项目项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用作用底物底物DNA分子分子DNA分子片段分子片段脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA分子分子作用作用部位部位作用作用结果结果形成黏性末端或平末端形成黏性末端或平末端形成重组形成重组DNA分子分子 形成新形成新DNA分子分子 形成单链形成单链DNA分子分子磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键碱基对间的氢键3基因进入受体细胞的载体“
5、分子运输车”考点一考点一重重组DNA技技术的基本工具的基本工具(1)作用：作用：将将外源基因外源基因送入送入受体细胞受体细胞。(2)常用载体常用载体：质粒质粒、噬菌体噬菌体、动植物病毒动植物病毒。(3)最常用载体：最常用载体：质粒质粒。本本质质：裸裸露露的的、结结构构简简单单、独独立立于于真真核核细细胞胞细细胞胞核核或或原原核核细细胞胞拟拟核核DNA之之外，并具有外，并具有自我复制能力自我复制能力的的环状双链环状双链DNA分子。分子。特特点点：有有一一个个至至多多个个限限制制酶酶切切割割位位点点，便便于于限限制制酶酶识识别别切切割割；能能自自我我复复制制，或或整整合合到到受受体体DNA上上同同
6、步步复复制制；有有特特殊殊的的标标记记基基因因，便便于于重重组组DNA分分子子的的筛筛选。选。2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI进行切割，B片段分别用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeI切割A片段产生的 DNA片段相连接?为什么?XbaI。因为XbaI与SpeI切割产生了相同的黏性末端。课 堂 测 评（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾
7、酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。2(生命观念生命观念)载体上标记基因的作用载体上标记基因的作用载载体体上上的的标标记记基基因因一一般般是是一一些些抗抗生生素素的的抗抗性性基基因因。目目的的基基因因要要转转入入的的受受体体细细胞胞没没有有抵抵抗抗相相关关抗抗生生素素的的能能力力。当当含含有有抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的载载体体进进入入受受体体细细胞胞后后，抗抗性性基基因因在在受受体体细细胞胞内内表表达达，使使受受体体细细胞胞能能够够抵抵抗抗相相应应抗抗生生素素，所所以以在在受受体体细细胞胞的的培培养养体体系系中中加加入入该该种种抗抗生生素素就就可可以以只只保保留留转转入入载载体体的的
8、受受体体细细胞胞，作用机理如图所示：作用机理如图所示：注意！注意！标记基因不一定基因不一定是抗性基因，是抗性基因，还可以是可以是荧光光标记基因。基因。判断正误。判断正误。1E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()2载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。()3DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。()4载载体体的的作作用用是是将将携携带带的的目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞中中，使使之之稳稳定定存存在在并并表表达达。()提提示示
9、：E.coli DNA连接接酶只只可可连接接黏黏性性末末端端，T4 DNA连接接酶既既可可连接接平平末末端端，又可又可连接黏性末端。接黏性末端。提示：提示：载体体质粒通常采用抗生素抗性基因作粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。基因。提示：提示：DNA连接接酶恢复被限制恢复被限制酶切开的磷酸二切开的磷酸二酯键。考向一考向一 围绕工具酶，考查生命观念围绕工具酶，考查生命观念典型例题典型例题1下列有关基因工程和酶的相关叙述，正确的是下列有关基因工程和酶的相关叙述，正确的是()A同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一
10、性B运载体的化学本质与载体蛋白相同运载体的化学本质与载体蛋白相同C限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸DDNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键答案：答案：C考向三围绕考向三围绕DNA的粗提取与鉴定，考查生命观念的粗提取与鉴定，考查生命观念典典型型例例题题3(2020海海南南卷卷)下下列列关关于于“DNA的的粗粗提提取取与与鉴鉴定定”实实验验的的叙叙述述，错错误误的是的是()A羊的成熟红细胞可作为提取羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料的材料B提取植物细胞的提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐时，需要加入一定量的洗涤
11、剂和食盐C预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止预冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解水解D在沸水浴条件下，在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色与二苯胺反应呈现蓝色答案：答案：A典典型型例例题题2下下表表中中列列出出了了几几种种限限制制酶酶识识别别序序列列及及其其切切割割位位点点，图图 1、图图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是()限制酶限制酶BamHHindiEcoRSma识别序列及切识别序列及切割位点割位点GGATCCCCTAGGAAGCTTTTCGAAGAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCA
12、重重组组 DNA 技技术术所所用用的的工工具具酶酶是是限限制制酶酶、DNA 连接酶和运载体连接酶和运载体B只只有有用用同同种种限限制制酶酶切切割割DNA 产产生生的的黏黏性性末端才能互补末端才能互补C用用图图中中质质粒粒和和外外源源基基因因DNA 构构建建重重组组质质粒，可使用粒，可使用Sma切割切割D使使用用 EcoR同同时时处处理理质质粒粒和和外外源源DNA，可能会发生质粒或者目的基因的自身环化，可能会发生质粒或者目的基因的自身环化答案：答案：D1(2021广广东月月考考)下下图图表表示示一一项项重重要要生生物物技技术术的的关关键键步步骤骤，X是是获获得得外外源源基基因并能够表达的细胞。下
13、列有关说法错误的是因并能够表达的细胞。下列有关说法错误的是()AX是能合成胰岛素的细菌细胞是能合成胰岛素的细菌细胞B质粒应具有一个或多个限制酶切点质粒应具有一个或多个限制酶切点C基因与载体的重组只需要基因与载体的重组只需要DNA连接酶连接酶D该细菌的性状被定向改造该细菌的性状被定向改造答案：答案：C目的基因的 筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序1 1目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取(1)(1)筛选合适的目的基因筛选合适的目的基因目目的的基基因因：在在基基因因工工程程的的设设计计和和操操作作中中，用用于于改改变变_或获得或获得_
14、等的基因。主要是指等的基因。主要是指_的基因。的基因。筛筛选选目目的的基基因因的的方方法法：从从相相关关的的已已知知_清清晰晰的的基基因因中中进进行筛选是较为有效的方法之一。行筛选是较为有效的方法之一。受体细胞性状受体细胞性状预期表达产物预期表达产物编码蛋白质编码蛋白质结构和功能结构和功能考点二考点二 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序考点二考点二 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序PCRPCR（聚合酶链式反应）扩增（聚合酶链式反应）扩增人工合成目的基因人工合成目的基因从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因获取获取目的基因目的基因的方法的方法概念：概念：PCR是聚
15、合酶链式反应聚合酶链式反应的缩写。在体外体外提供参与参与DNADNA复制复制的各种组分各种组分与反应条件反应条件，对目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列进行大量复制大量复制的技术。PCRPCR扩增仪扩增仪目的、优点目的、优点(2)(2)利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因(2)(2)利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因原理：原理：DNADNA半保半保留留复制复制。条件：条件：DNADNA模板模板（目的基因所在的（目的基因所在的DNADNA片段）片段）2 2种引物种引物 耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶、4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸、缓冲液（
16、含缓冲液（含Mg2Mg2+）控制控制_,_,使使DNADNA复制在体外反复进行复制在体外反复进行（作作用用：分分别别与与单单链链相相应应序序列列相相结结合合，使使DNADNA聚聚合合酶酶能能够从引物的够从引物的_端开始连接）端开始连接）温度33变性变性当温度上升到当温度上升到9090以以上上时，时，双链双链DNADNA自动自动解解聚为单链聚为单链。335 5335 5335 5335 5335 5335 5335 5335 5不需要解旋酶不需要解旋酶当温度下降到当温度下降到5 500左右左右时，时，两种引物两种引物通过通过碱基互补配对碱基互补配对与两条单链与两条单链DNADNA结合结合复性复性
17、延伸延伸当温度上升到当温度上升到7272左右左右时，时，溶液中的溶液中的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温的耐高温的DNADNA聚合酶聚合酶的作用的作用下，根据碱基互补配对原下，根据碱基互补配对原则则延伸合成延伸合成新的新的DNADNA链链335 5335 5335 5335 595955 5007272退火退火PCRPCR反应的过程反应的过程（变性（变性-复性复性-延伸）延伸）第一轮循环的第一轮循环的产物产物作为第二作为第二轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第二轮循产生第二轮循环的产物。环的产物。第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第
18、三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物。产物。第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，常完成以后，常采用采用_来来鉴定鉴定PCRPCR的产的产物。物。结果：经过结果：经过n n轮轮PCRPCR，DNADNA分分子子就以就以_ 的形式增加的形式增加。琼脂糖凝胶电泳PCRPCR反应的过程反应的过程（变性（变性-复性复性-延伸）延伸）获得目的基因后直接转入受体吗？不可以，游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再
19、含有目的基因。第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心）终止子终止子启动子启动子目的基因目的基因标记基因标记基因复制原点复制原点基因基因表达表达载体载体DNADNA复制所需结构复制所需结构2 2基因表达载体的构建基因表达载体的构建-基因工程的核心基因工程的核心(1)(1)目目的的：使使目目的的基基因因，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)(2)基因表达载体的组成及作用基因表达载体的组成及作用在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代考点二考点二 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序注意注意!目的基因必
20、须插入到启动子与终止子之间。重组DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位点获取目的基因DNA连接酶基因表达载体构建模式图限制酶启动子限制酶切割位点终止子标记基因复制原点质粒同种限制酶或能产生相同末端的限制酶2 2基因表达载体的构建基因表达载体的构建问题：问题：该过程需要用到该过程需要用到基因工程基因工程哪些工具哪些工具？实践活动实践活动 、自己动手构建基因表达载体、自己动手构建基因表达载体质粒片段质粒片段目的基因目的基因所在片段所在片段操作：环化质粒，然后质粒上找到操作：环化质粒，然后质粒上找到EcoR1 EcoR1 的识别序列（的识别序列（GAATTCGAATTC）并切割，）并切割，用同种酶切割
21、目的基因用同种酶切割目的基因实践活动二实践活动二 、自己动手构建基因表达载体、自己动手构建基因表达载体质粒自身环化、目的基因自身环化、目的基因与质粒反向连接存在的缺点：2.2.如何如何防止防止目的基因和质粒的目的基因和质粒的自身环化自身环化以及目的基因的以及目的基因的反向连接反向连接？选择选择两种不同的限制酶同时两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割对目的基因和质粒切割问题探讨：问题探讨：考点二考点二 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序下列质粒和目的基因应选择哪种酶进行切割？下列质粒和目的基因应选择哪种酶进行切割？延伸应用(1)不破坏目的基因原则：不破坏目的基因原则：如图甲中可选择
22、Pst，而不选择Sma。(2)保保留留标标记记基基因因、启启动动子子、终终止止子子、复复制制原原点点原原则则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma。图解限制酶的选择原则图解限制酶的选择原则(3)确确保保出出现现相相同同黏黏性性末末端端原原则则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中Pst；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择Pst和EcoR两种限制酶。易错提醒项目启动子启动子终止子终止子起始密码子起始密码子终止密码子终止密码子本质本质_位置位置目的基因上游目的基因下游mRNA首
23、端mRNA尾端功能功能_DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号(编码氨基酸)翻译的结束信号(不编码氨基酸)启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比1.1.转化转化是指目的基因是指目的基因进入受体细胞进入受体细胞内，并且在受体细胞内内，并且在受体细胞内维持维持稳定和表达稳定和表达的过程的过程。此处。此处“转化转化”与肺炎链球菌转化实与肺炎链球菌转化实验中的验中的“转化转化”含义相同，实质都是含义相同，实质都是基因重组基因重组。不同生物转化方法不同不同生物转化方法不同常用常用方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物
24、细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法花粉管通道法花粉管通道法显微显微注射法注射法CaCa2+2+处理法处理法3将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞花粉管通道法花粉管通道法（我国科学家我国科学家独创）独创）子房子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊用用微量注射器微量注射器将含目的基因的将含目的基因的DNADNA溶液溶液直接直接注入注入子房子房中中。在植物在植物受粉后受粉后的一定时间内，的一定时间内，剪去柱剪去柱头头，将，将DNADNA溶液滴加在花柱切面上，使溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助目的基
25、因借助花粉管通道花粉管通道进入进入胚囊胚囊。操作方式操作方式:3将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法（常用）1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的过程：农杆菌转化法的过程：T-DNA目的基因目的基因构建表达载体构建表达载体含目的基因的含目的基因的重组重组TiTi质粒质粒转入农杆菌转入农杆菌含重组含重组TiTi质粒的农杆菌质粒的农杆菌导入植物细胞导入植物细胞植物细胞植物细胞将目的基因将目的基因插入插入染色体染色体DNADNA中中表现出表现出新性状新性状的植物的植物植物植物组织组织培养培养受体细胞：受体细胞：体细胞或受精卵体细胞或受精卵(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基
26、因拼接到Ti质粒的上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入。TDNA染色体DNA农杆菌受体细胞(2)农杆菌特点能在自然条件下侵染和，而对大多数_没有侵染能力。农杆菌细胞内含有，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。双子叶植物裸子植物单子叶植物Ti质粒2.将目的基因导入动物细胞显微注射法显微注射法（1）受体细胞：受精卵受精卵（受精卵受精卵容易容易表现出表现出全能性全能性）（2）过程：构建构建基因表达载体并基因
27、表达载体并提纯提纯利用利用显微注射显微注射将基因表达将基因表达载体注入动物的载体注入动物的受精卵受精卵中中早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植获得具有获得具有新性状新性状的的转基因动物转基因动物P82注射绿色荧光基因3.目的基因导入微生物细胞Ca2+处理法（1）受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。（2）一般过程：一般先用Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态再将重组的基因表达载体导入其中Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞3将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定检测水平检测水平检测目的检测目的检测方法检测方法分
28、子分子水平水平目的基因是否插入到转基因生目的基因是否插入到转基因生物染色体物染色体DNADNA上上_目的基因是否转录出了目的基因是否转录出了mRNAmRNA目的基因是否翻译出蛋白质目的基因是否翻译出蛋白质_个体水平个体水平转基因生物是否表现出相应的转基因生物是否表现出相应的特性特性如抗虫、抗病的如抗虫、抗病的接种实验接种实验PCR/PCR/分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原抗体杂交抗体杂交考点二考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）4DNA的粗提取与鉴定4DNA的粗提取与鉴定（3）DNA的粗提取与鉴定操作流
29、程的粗提取与鉴定操作流程破碎细胞：破碎细胞：称取洋葱称取洋葱切碎切碎倒入倒入10 mL研磨液研磨液充分研磨充分研磨去除杂质：去除杂质：用用纱纱布布过过滤滤洋洋葱葱研研磨磨液液滤滤液液放放入入4 冰冰箱箱静静置或倒入塑料离心管离心置或倒入塑料离心管离心取上清液取上清液DNA的析出：的析出：加加等等体体积积、预预冷冷的的酒酒精精溶溶液液(体体积积分分数数为为95%)静静置置用用玻玻璃璃棒棒沿沿一一个个方方向向搅搅拌拌，卷卷起起白白色色丝丝状状物物，用用滤滤纸纸吸吸去去水水分分或或倒倒入塑料离心管离心，弃上清液，将管底沉淀物晾干入塑料离心管离心，弃上清液，将管底沉淀物晾干DNA的鉴定：的鉴定：取取甲
30、甲、乙乙两两支支试试管管，分分别别加加入入2 mol/L的的NaCl溶溶液液5 mL将将丝丝状状物物或或沉沉淀淀物物溶溶于于甲甲试试管管的的NaCl溶溶液液中中分分别别加加入入4 mL二二苯苯胺胺试试剂剂，混混合合均均匀匀后后将将试试管管置置于于沸沸水水中中加加热热5 min冷却后观察两试管中溶液冷却后观察两试管中溶液颜色颜色变化变化结果：结果：甲试管变甲试管变蓝色蓝色，乙试管不变色，乙试管不变色(1)PCR原原理理：利利用用了了_原原理理，通通过过调调节节温温度度来来控控制制DNA双双链链的的解聚与结合。解聚与结合。(2)电电泳泳：DNA分分子子具具有有可可解解离离的的基基团团，在在一一定定
31、的的pH下下，这这些些基基团团可可以以带带上上正正电电荷荷或或负负电电荷荷。在在电电场场的的作作用用下下，这这些些带带电电分分子子会会向向着着与与它它所所带带电电荷荷_的的电极移动，这个过程就是电泳。电极移动，这个过程就是电泳。(3)PCR的的产产物物一一般般通通过过_来来鉴鉴定定。在在凝凝胶胶中中DNA分分子子的的迁迁移移速率与凝胶的浓度、速率与凝胶的浓度、DNA分子的分子的_等有关。等有关。DNA的热变性的热变性相反相反琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳大小和构象大小和构象1实验基础考点二考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 凝胶中的凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为分子通过
32、染色，可以在波长为300 nm的的_下被检测出来。下被检测出来。2PCR实验操作步骤3DNA的测定：考点二考点二基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序紫外灯紫外灯1图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH 和Sau3A 三种限制酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A 的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)若某人利用图(b)所示的
33、表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示，这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。E.coli DNA连接酶连接酶甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录甲、丙甲、丙T4 DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶1.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙
34、述，错误的是A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D D2.(2019江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热A A3.(2020北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动
35、子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A.B.C.D.B B6.戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态D.过程大量制备
36、pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定D D4（2022广东高考）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题：(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对_，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_，终止
37、子的作用是_。引物 筛选含有基因表达载体的受体细胞终止转录，使转录在需要的地方停下来(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了_，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于_ _，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。不仅不排放CO2，而且还可以消耗工业废气中的CO2CO2等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长废物的资源化5（2022河北高考）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑
38、制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是_。(2)_是实施基因工程的核心。(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的_上，此方法的不足之处是_。(4)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有_（写出两点即可）。调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达 到抗虫的目的到抗虫的目的基因表达载体的构建基因表达载体的构建T-DNAT-DNA该方法不适用与单子叶植物该方法不适用与单子叶植物PCRPCR扩增
39、技术或扩增技术或分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗原-抗体杂交技术抗体杂交技术(5)确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的_以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析_（填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPIStPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是_。(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生_。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是_（写出两点即可）。在胰蛋白酶抑制剂的选择下，在胰蛋白酶抑制
40、剂的选择下，抗性抗性基因频率逐渐增高，基因频率逐渐增高，从而从而提升了其提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力抗胰蛋白酶抑制剂的能力；或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂不能编码处胰蛋白酶抑制剂接种实验接种实验NaPINaPI饲喂饲喂NaPINaPI转基因的虫体质量较对照组差，转基因的虫体质量较对照组差，且每株棉铃数较对照组少且每株棉铃数较对照组少定向改变定向改变8.某质粒上有Sal、Hind、BamH三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：(1)将目的基因导入植物细胞
41、，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_。该方法中农杆菌的作用是_。Ti质粒TDNA侵染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind和Sal两种酶的好处是_。防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？_(填“是”或“否”)。为什么？_。否含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏(4)将已经转化的农杆菌进行如
42、下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。2.第三代疫苗DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是Bgl、EcoR和Sau3A。下列分析错误的是A.构建DNA疫苗时，可用Bgl和
43、Sau3A切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoR切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C.用EcoR切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶C C3(2022天津期中天津期中)下列关于下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是操作过程的叙述，错误的是()APCR实实验验中中使使用用的的微微量量离离心心管管、枪枪头头、缓缓冲冲液液以以及及蒸蒸馏馏水水等等在在使使用用前前必必须须进进行高压灭菌行高压灭菌BPCR利用了利用了DNA的热变性原理的热变性原理CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在在向
44、向微微量量离离心心管管中中添添加加反反应应组组分分时时，每每吸吸取取一一种种试试剂剂后后，移移液液器器上上的的枪枪头头都都必须更换必须更换C4下列有关电泳的叙述，错误的是下列有关电泳的叙述，错误的是()A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B待待测测样样品品中中各各种种分分子子的的形形状状、大大小小及及带带电电性性质质的的差差异异等等会会影影响响其其在在电电泳泳中中的的迁移速度迁移速度C进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动D常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳常
45、用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳答案：答案：C5在在基基因因工工程程操操作作过过程程中中，科科研研人人员员利利用用识识别别两两种种不不同同序序列列的的限限制制酶酶(R1和和R2)处处理理基基因因载载体体，进进行行聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳检检测测，结结果果如如下下图图所所示示。以以下下相相关关叙叙述中，不正确的是述中，不正确的是 ()A该载体最可能为环状该载体最可能为环状DNA分子分子B两种限制酶在载体上各有一个酶切位点两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C限制酶限制酶R1与与R2的切点最短相距约的切点最短相距约200 bpD限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂解解析析：限限制制酶切切割割DNA分分子子，破破坏坏的的是是作作用用位位点点上上两两个个脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸之之间的磷酸二的磷酸二酯键，D错误。答案：答案：D