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1、切：切：酶切酶切限限制制性性内内切切酶酶(restriction endonuclease，RE)：能能够够识识别别和和水水解解DNA分分子子内内特特异异序序列列的的核核酸酸水水解解酶酶类。类。基因的剪刀基因的剪刀细细菌菌中中存存在在位位点点特特异异性性限限制制酶酶和和特特异异性性甲甲基基化化酶酶，构构成成了了寄寄主主控控制制的的限限制制修修饰饰系系统统(Restriction-modification system，R-M)，是是细细菌菌安安内内御御外外的的积积极极措施。措施。细细菌菌R-M系系统统的的限限制制酶酶可可以以降降解解DNA，为为避避免免自自身身DNA的的降降解解，细细菌菌可可以
2、以修修饰饰（甲甲基基化化酶酶）自自身身DNA，未被修饰的外来，未被修饰的外来DNA则会被降解。则会被降解。限制限制修饰系统修饰系统限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名属名种名菌株类型发现的顺序属名种名菌株类型发现的顺序EcoR IEscherichia属名属名coli种名种名Ry13株系株系 编号编号限制性内切酶名称的英文缩写前限制性内切酶名称的英文缩写前限制性内切酶名称的英文缩写前限制性内切酶名称的英文缩写前3 3个字母要用个字母要用个字母要用个字母要用斜体斜体斜体斜体。Approximately 2600 different restriction enzymes are know
3、n,with over 230 cleavage specificities.性质性质型型型型型型结构与功能结构与功能三亚基多功能酶三亚基多功能酶单一功能的酶单一功能的酶同型二聚体同型二聚体二亚基双功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰限制与修饰酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用酶蛋白酶蛋白不不具有甲基具有甲基化作用化作用酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用辅助因子辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM切割位点切割位点在距特异性位点在距特异性位点至至少少1kb的地方的地方位于位于特异性位点特异性位点或或其附近其附近在距在距特异性位点特异性位点3端
4、端2426bp处处切割方式切割方式随机随机切割切割特异特异切割切割特异特异切割切割用途用途无无十分有用十分有用有用有用限制性内切酶分类限制性内切酶分类识别特定的核苷酸序列识别特定的核苷酸序列48个碱基对个碱基对(回文结构回文结构)限制性核酸内切酶的切割特点限制性核酸内切酶的切割特点回文结构：回文结构：同一条单链以中心轴对折可形同一条单链以中心轴对折可形成互补的双链。成互补的双链。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGG识别序列的长度识别序列的长度一般为一般为48个碱基，最常见的为个碱基，最常见的为6个碱基个碱基.4 bp识别序列：识别序列：Sau3AI GATC5 bp识别序列：识别序
5、列：EcoR CCWGG(W=A/T)6 bp识别序列：识别序列：EcoR GAATTC7 bp识别序列：识别序列：BbvCI CCTCAGC8 bp识别序列：识别序列：NotI GCGGCCGCBamH GTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHind GTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口切开切开双链双链DNA。形成。形成粘性末端粘性末端（sticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt end）。如：）。如：根据根据其识别位点及切开后序列情况其识别位点及切开后序列情况，可以分为，可以分为:同工异源酶（同工异源酶（isosch
6、izomer）同尾酶（同尾酶（isocaudamer）来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同工异源酶（可以相互代替）酶称同工异源酶（可以相互代替）。又称为同裂酶。又称为同裂酶。同工异源酶（同工异源酶（isoschizomer）：）：完全同裂酶：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如识别位点和切点完全相同。如Hind 和和Hsu I。HindHind 5-5-A A AGCTT-3AGCTT-3 3-3-TT CGATT CGA A A-55HsuHsu I 5-A I 5-A AGCTT-3 AGCTT-3 3-TTCGA3-TTCGA
7、A-5A-5Xma I 5-C CCGGG-3 3-GGGCC C-5Sma I 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5识别位点相同，但切点不同。如识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶：BamBamH H BgBgl l IIII GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。+同尾酶（同尾酶（isocaudamer）：）：
8、同尾酶的粘性末端互相结合后形成的同尾酶的粘性末端互相结合后形成的位点，位点，一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。5-G5-G3-C3-CCTAGCTAGGATCGATCT T-3-3 A A-5-5BamBamH IH IBglBgl 5-G5-GGATCGATCT T-3-3 3-C3-CCTAGCTAGA A-5-5BamBamH IH IBglBgl DNA连接酶作用是封闭双螺旋骨连接酶作用是封闭双螺旋骨架上具有架上具有5-磷磷酸酸基基和和3-羟基的羟基的切口切口，形成磷酸二酯键。形成磷酸二酯键。主要有两种：主要有两种：大肠杆菌的大肠杆菌的DNA连连接酶接酶和和T4噬菌体
9、的噬菌体的DNA连接酶连接酶。（二）（二）DNA连接酶（连接酶（ligase）DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶5 G-C-T-C-T-G-C-A 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3G-G-A-G 33 C-G-A-G 3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5A-C-G-T-C-C-T-C 5OHOH PPOHOHPP5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 35 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 53 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5nicknicknickni
10、ck（T4DNA连接酶连接酶）T4 DNA连接酶来自于连接酶来自于T4噬菌体感染的噬菌体感染的E.coli，为，为T4噬噬菌体自身的表达产物。辅因子为菌体自身的表达产物。辅因子为ATP，该酶既能连接粘性末，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐端，亦能连接齐平末端平末端。目目前前应应用用的的多多数数来来自自于于大大肠肠杆杆菌菌，称称为为E.coli DNA连连接接酶酶。辅辅因因子子NAD+，只只能能连连接接粘粘性性末末端端，不不能能连连接接平平末末端端 DNA分子。分子。切口nick 缺口 gapDNA连接酶只能作用于双链连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将分子而不能将二个单链二个单链DNA分子连
11、接分子连接1.碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来，从小牛肠中纯化出来，CIP的比活性比的比活性比BAP高高出出10倍以上。倍以上。SDS中加热中加热68oC可完全失活。可完全失活。碱性磷酸酶碱性磷酸酶多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶是一种磷酸化激酶，可将是一种磷酸化激酶，可将ATP的
12、的-磷磷酸基团转移到酸基团转移到DNA或或RNA的的5末端。末端。分子克隆中呈现分子克隆中呈现2种反应种反应将将ATP的的-磷酸基团转移到无磷酸的磷酸基团转移到无磷酸的DNA5-OH末端末端（前向反应）（前向反应）在过量在过量ATP存在的情况下，可将存在的情况下，可将DNA的的5-P转移给转移给ADP，然后，然后DNA从从ATP中获得中获得-磷酸而重新磷酸化。磷酸而重新磷酸化。（交换反应）（交换反应）应用对缺乏对缺乏5-P的的DNA进行磷酸化。进行磷酸化。对对DNA末端进行放射性标记（末端进行放射性标记（-32P-ATP）。）。DNA聚合酶DNA聚聚合合酶酶（DNA polymerase）是是
13、细细胞胞复复制制DNA的的重重要要作作用用酶酶。DNA聚聚合合酶酶以以DNA为为复复制制模模板板，将将DNA由由5端点开始复制到端点开始复制到3端端。DNA聚聚合合酶酶的的主主要要活活性性是是在在具具备备模模板板、引引物物、dNTP等的情况下催化等的情况下催化DNA的合成。的合成。共同性质是：共同性质是：1.以脱氧核苷酸三磷酸（以脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合）为前体催化合成成DNA;2.需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在;3.不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链；链；4.催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端；5.催化催化DNA合成的方向是
14、合成的方向是53。逆转录酶逆转录酶（依赖于（依赖于RNA的的DNA聚合酶）聚合酶）反反转转录录酶酶(reverse transcriptase)即即依依赖赖于于RNA的的DNA聚聚合合酶酶，它它以以RNA为为模模板板、4种种dNTP为为底底物物，催催化化合成合成DNA，此，此过程称为逆转录。过程称为逆转录。DNA聚合酶活性；以聚合酶活性；以RNA为模板，在为模板，在引物引物tRNA 3OH末端以末端以53方向合成方向合成DNA。逆转录酶逆转录酶功能功能RNase H活性活性：以：以5 3或或3 5方向特异地水方向特异地水解解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链。链。依赖依赖DNA的的
15、DNA聚合酶活性：以反转录合成的第一聚合酶活性：以反转录合成的第一条条DNA单链为模板，以单链为模板，以dNTP为底物，合成第二条为底物，合成第二条DNA分子。分子。来来源源于于小小牛牛胸胸腺腺，是是一一种种不不依依赖赖于于模模板板的的DNA聚合酶聚合酶，5 3DNA聚合酶活性。聚合酶活性。在在Co2+/Mg2+存存在在下下，末末端端转转移移酶酶催催化化dNTP加加于于DNA分子的分子的3-OH端。端。末端转移酶末端转移酶(terminal transferase)基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异
16、序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶（T4DNA聚合酶；聚合酶；热稳定热稳定DNA聚合酶）聚合酶）合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活探分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；针；DNA序列分析；填补序列分析；填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。外切活性。常用于常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基