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1、单克隆抗体的制备二单克隆抗体的制备二Questionsl如何应用杂交瘤技术获得针对特定抗原的单克隆抗体如何应用杂交瘤技术获得针对特定抗原的单克隆抗体？l单克隆抗体单克隆抗体制备的具体操作流程是什么？制备的具体操作流程是什么？3免疫动物免疫动物分离脾细胞分离脾细胞人肌红蛋白人肌红蛋白致敏致敏B细胞的制备细胞的制备脾细胞脾细胞（B淋巴细胞）淋巴细胞）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞融合的骨髓融合的骨髓瘤细胞瘤细胞未融合的骨未融合的骨髓瘤细胞髓瘤细胞未融合的脾细胞未融合的脾细胞分泌抗体分泌抗体寿命短寿命短不分泌抗体不分泌抗体寿命长寿命长不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活PEG融
2、合融合融合的脾细胞融合的脾细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞融合的骨髓瘤细胞融合的骨髓瘤细胞未融合的骨未融合的骨髓瘤细胞髓瘤细胞杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理死亡死亡存活存活HAT培养基筛选培养基筛选?杂交瘤细胞的特点杂交瘤细胞的特点n能分泌单克隆抗体能分泌单克隆抗体n长期体外繁殖长期体外繁殖对对B B细胞的要求细胞的要求u高特异性高特异性u高效价高效价u高亲和力高亲和力技术技术要点要点（一）亲本细胞的选择与制备（一）亲本细胞的选择与制备123细胞株稳定，细胞株稳定，易于传代培养易于传代培养本身不本身不分泌分泌IgIg或或细胞因子细胞因子4与与B细胞融细胞融合率高合率高HGPRT缺陷缺陷细胞株
3、细胞株对骨髓瘤细胞的要求对骨髓瘤细胞的要求化学方法：化学方法：如聚乙二醇（如聚乙二醇（PEGPEG），分子量），分子量1-2kDa1-2kDa，浓，浓度度30-50%30-50%。原理：使细胞膜打开，细胞膜上脂类物质的物理结构重原理：使细胞膜打开，细胞膜上脂类物质的物理结构重排，利于融合。排，利于融合。物理方法：物理方法：电场诱导电场诱导生物学方法：仙台病毒生物学方法：仙台病毒（二）细胞融合（二）细胞融合致敏淋致敏淋巴细胞巴细胞骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞离心离心 1000rpm 10min50%PEG 1ml培养液培养液 10ml离心离心 1000rpm 7min37摇动、由摇动、由慢渐快慢渐快1m
4、in、静止静止1.5min加入加入HAT培养培养液悬浮细胞，液悬浮细胞，置于培养孔内置于培养孔内致敏致敏B B细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞与骨髓瘤细胞的融合H，Hypoxanthine，次黄嘌呤；次黄嘌呤；A，Aminopterin，甲甲氨蝶呤氨蝶呤；T，Thymidine，胸腺嘧啶胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径(主要途径主要途径)糖或氨基酸二二二二氢氢叶酸叶酸叶酸叶酸还还原原原原酶酶AHHT T外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径)(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移
5、酶 (HGPRT)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (TK)(Thymidine kinase)外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径)HAT培培养养基基筛筛选选B B淋巴细胞：淋巴细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+存活存活骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：HGPRTHGPRT-，TKTK+死亡死亡（三）杂交瘤细胞的选择性培养（三）杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞：杂交瘤细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+存活存活HATHAT培养基的筛选培养基的筛选融合后细胞混合液融合后细胞混合液HAT培养基培养基2 weeks laterHT培养基培养基正常培养基正常培养基1 week laterl有限稀释法：有限
6、稀释法：最常用最常用l显微操作法：显微操作法：易污染易污染l软琼脂培养法：软琼脂培养法：琼脂温度难控制琼脂温度难控制l流式细胞术：流式细胞术：价格昂贵价格昂贵（四）阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化（四）阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化l冻存：冻存：“缓冻缓冻”l复苏：复苏：“速溶速溶”（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏（五）杂交瘤细胞的冻存与复苏l动物体内诱生法动物体内诱生法l体外培养法体外培养法（六）单克隆抗体的生产（六）单克隆抗体的生产动物体内诱生法动物体内诱生法Balb/c小鼠小鼠注射注射降降植烷或医用石蜡植烷或医用石蜡无菌性无菌性腹膜炎腹膜炎注射注射100100万个万个杂交瘤细胞杂交瘤细胞7-107
7、-10天后天后采集腹水采集腹水收集上清，收集上清，分离抗体分离抗体体外培养法体外培养法大规模培养大规模培养18免疫动物免疫动物分离脾细胞分离脾细胞处于对数生长期处于对数生长期的骨髓瘤细胞的骨髓瘤细胞融合融合HAT筛选筛选人肌红蛋白人肌红蛋白YYYYYYYYYYYYYYYYYY单克隆抗体的检测单克隆抗体的检测YYYYYYYY杂交瘤杂交瘤细胞细胞YYYYYYYYYYYYYYYYYY大量制备大量制备mAb杂交瘤细杂交瘤细胞的克隆胞的克隆化培养化培养小结小结-用杂交瘤技术制备人肌红蛋白为用杂交瘤技术制备人肌红蛋白为例例思考题思考题请通过查阅文献，找出如何应用杂交瘤技术制备请通过查阅文献，找出如何应用杂交瘤技术制备PD-1PD-1单抗？单抗？