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1、实验九实验九 外源基因在大肠杆菌外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测中的诱导表达和检测 一实验目的一实验目的n n1通过本实验掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法；n n2掌握SDS-PAGE的制备及其分离原理。二实验原理二实验原理n n本实验介绍一种常用的表达载体本实验介绍一种常用的表达载体pETpET载体系统。在载体系统。在pETpET系列载体中，外源基因的表达受系列载体中，外源基因的表达受T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶的调控，聚合酶的调控，这类载体是这类载体是StudierStudier等于等于19901990年首先构建的，后来得到很大发年首先构建的，后来得到很大发展。它们的
2、典型特点是带有展。它们的典型特点是带有pBR322pBR322的大肠菌素的大肠菌素E1(colEl)E1(colEl)复复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7 RNAT7 RNA聚聚合酶启动子合酶启动子(10(10启动子启动子)或所谓的或所谓的T7 lacT7 lac启动子的控制之下，启动子的控制之下，后者是带有后者是带有laclac操纵子操纵子(larO)(larO)序列的天然序列的天然T7 RNAT7 RNA聚合酶启动子聚合酶启动子的衍
3、生体。的衍生体。laclac阻抑物的结合能阻断转录起始。阻抑物的结合能阻断转录起始。n n将外源基因克隆在含有将外源基因克隆在含有laclac启动子的启动子的pET-30apET-30a表达载体（如图表达载体（如图1 1）中，让其在）中，让其在E.coliE.coli中表达。先让宿主菌生长，中表达。先让宿主菌生长，lacIlacI产生的阻产生的阻遏蛋白与遏蛋白与lacIlacI操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入laclac操纵操纵子的诱导物子的诱导物IPTG
4、(IPTG(异丙基硫代异丙基硫代-D-D-半乳糖半乳糖 )，阻遏蛋白不能与，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则操纵基因结合，则DNADNA外源基因大量转录并高效表达，表达外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经蛋白可经SDS-PAGESDS-PAGE检测。检测。SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理n n组成蛋白质的氨基酸在一定组成蛋白质的氨基酸在一定pHpH的溶液中会发的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的取决于蛋白质的性质及溶液的pHpH值和离子强值和离子强度。聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简度。聚丙烯酰胺凝胶在催
5、化剂过硫酸铵（简称称ApAp）和加速剂）和加速剂N,N,NN-N,N,NN-四甲基乙二胺（简四甲基乙二胺（简称称TEMEDTEMED）的作用下，聚合形成三维的网状）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。n nSDS-PAGE SDS-
6、PAGE 是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙和含有巯基乙和含有巯基乙和含有巯基乙醇的样品处理液，醇的样品处理液，醇的样品处理液，醇的样品处理液，SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性是一种很强的阴离子表面活性是一种很强的阴离子表面活性是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。分子的二级和三级结构。分子的二级和三级结构。分子的二级和三级结构
7、。n n 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与解聚后的侧链与解聚后的侧链与解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS-SDS复合物。复合物。复合物。复合物。n n 蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负
8、电荷的量远阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。关。蛋白表达系统n n大肠杆菌表达系统是目前研究最成熟的基因工程表达系统，大肠杆菌表达系统是目前研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。突出
9、的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达然而，大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力：许多蛋白质在翻译后，调控机制和蛋白质的加工修饰能力：许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工（如磷酸化、糖基化、酰胺化及需经过翻译后的修饰加工（如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等）过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少蛋白酶水解等）过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高
10、级结蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。增加了成本。酵母表达系统酵母表达系统n n酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养
11、，遗传操作简单等原核生物的特点易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有对表达的蛋白质进行正确加工，外，又具有对表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等真核生物的功能，修饰，合理的空间折叠等真核生物的功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。足。酿酒酵母在分子遗传学方面被人们认识最早，也是酿酒酵母在分子遗传学方面被人们认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。最先作为外源基因表达的酵母宿主。19811981年利用酿酒酵年利用酿酒酵母成功表达了第一个外源基因母
12、成功表达了第一个外源基因-干扰素基因，随后又有干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。干扰素和胰岛素虽一系列外源基因在该系统得到表达。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝拷贝数
13、下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，局限，19831983年美国年美国WegnerWegner等人最先发展了以甲基营养型等人最先发展了以甲基营养型酵母（酵母（methylotrophic yeastmethylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。）为代表的第二代酵母表达系统。安
14、速商务服务枭痋爿n n甲基营养型酵母包括：甲基营养型酵母包括：PichiaPichia、CandidaCandida等以等以Pichia.pastorisPichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点pp具有醇氧化酶具有醇氧化酶AOX1AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。理最严格的
15、启动子之一。pp表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。稳定整合。pp菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。pp毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。Pichia.pastorisPichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统。利用强效可调控启动子为较
16、完善的外源基因表达系统。利用强效可调控启动子AOX1AOX1，已高效表达了，已高效表达了HBsAgHBsAg、TNFTNF、EGFEGF、破伤风毒、破伤风毒素素 C C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模。目前美国大为工业规模。目前美国FDAFDA已能评价来自该系统的基已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的因工程产品，最近来自该系
17、统的CephelonCephelon制剂已获得制剂已获得FDAFDA批准。批准。毕赤酵母宿主菌常用的有毕赤酵母宿主菌常用的有GS115GS115和和KM71KM71两种，都具有两种，都具有HIS4HIS4营养缺陷标记。营养缺陷标记。三实验材料三实验材料n n表达质粒：pET-30a-GFP四实验步骤四实验步骤1 1目的蛋白的表达目的蛋白的表达（1 1）含外源基因的表达菌株在）含外源基因的表达菌株在LBLB培养基（含培养基（含50g/ml Kana50g/ml Kana）中预培养过夜）中预培养过夜（2 2）按）按1/501/50的比例稀释菌液，于的比例稀释菌液，于250r/min250r/min
18、，培，培养养3 3小时小时,使其使其OD600OD600值达到值达到0.60.6（3 3）加入）加入IPTGIPTG，使其终浓度为，使其终浓度为0.5mmol/L0.5mmol/L（4 4）继续培养）继续培养1212小时小时（5 5）取）取1.5ml1.5ml菌液于菌液于10000r/min10000r/min，离心，离心2min2min，收获菌体收获菌体2 2目的蛋白的检测目的蛋白的检测（1 1）凝胶制备）凝胶制备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约将分离胶注入玻板后，用去离子水封
19、口，约3040min3040min后凝聚。后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。（2 2）凝胶电泳）凝胶电泳 取取80 ml 80 ml 电极缓冲液稀释电极缓冲液稀释5 5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V80V恒恒压压2020分钟，分钟，120V120V恒压恒压2 2小时小时 （3 3）染色、脱色）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.51 0.5
20、1 小时；之后，在脱色小时；之后，在脱色液中脱色液中脱色1 1小时，观察目的蛋白表达情况。小时，观察目的蛋白表达情况。凝聚组份10分离胶（5 ml）5浓缩胶（2 ml）水30%丙烯酰胺混合液1mol/LTris(pH6.8)1.5mol/LTris(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED1.91.71.30.050.050.0021.40.330.250.020.020.002五注意事项五注意事项n n1 1含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导表达。表达。n n2 2表达菌生长至表达菌生长至OD600OD600值值0.60.6左右为诱导适合条件，左右为诱导适合条件，避免菌生长过浓。避免菌生长过浓。n n3 3配制配制SDSSDS胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中，胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。并待其充分凝固后使用。六思考题六思考题1原核表达目的蛋白的基本原理是什么？2SDS-PAGE电泳的原理是什么？