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1、试验试验八：八：GFP在大在大肠肠杆菌中杆菌中的的诱导诱导表达和表达和检测检测 XIAMEN UNIVERSITYXIAMEN UNIVERSITYXIAMEN UNIVERSITY宋宋 刚刚 2188275 gangsongsdhotmail 厦厦门门高校抗癌探高校抗癌探讨讨中心中心一一试验试验目的目的n n驾驭驾驭外源基因在原核外源基因在原核细细胞中表达的特点胞中表达的特点和方法。和方法。n n复复习习SDS-PAGE的制的制备备及其分及其分别别原理。原理。二原核表达的一般流程二原核表达的一般流程获得目的基因 准备表达载体 将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌 诱导靶蛋白的表
2、达 表达蛋白的分析 扩增、纯化、进一步检测原核表达：将克隆化基因插入合适原核表达：将克隆化基因插入合适载载体后体后导导入大入大肠肠杆菌用杆菌用于表达大量蛋白于表达大量蛋白质质的方法一般称的方法一般称为为原核表达。原核表达。这这种方法在种方法在蛋白蛋白纯纯化、定位及功能分析等方面都有化、定位及功能分析等方面都有应应用。大用。大肠肠杆菌用杆菌用于表达重于表达重组组蛋白有以下特点：蛋白有以下特点：易于生易于生长长和限制；和限制；用于用于细细菌培育的材料不及哺乳菌培育的材料不及哺乳动动物物细细胞系胞系统统的材料的材料昂昂贵贵；有各种各有各种各样样的大的大肠肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特杆菌菌株及与之匹
3、配的具各种特性的性的质质粒可供粒可供选择选择。但是，在大但是，在大肠肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰饰和糖和糖基化、磷酸化等翻基化、磷酸化等翻译译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。白的生物学活性及构象。三三试验试验原理原理表达载体在基因工程中具有特别重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：选择标记的编码序列；可控转录的启动子；转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；一个多限制酶切位点接头；宿主体内自主复制的序列。原核表达原核表达载载体：体：pET载载体系体系统统n n本本试验试验介介绍
4、绍一种常用的表达一种常用的表达载载体体pETpET载载体系体系统统。n n 在在pETpET系列系列载载体中，外源基因的表达受体中，外源基因的表达受T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合聚合酶酶的的调调控，控，这类载这类载体是体是StudierStudier等于等于19901990年首先构建的，年首先构建的，后来得到很大后来得到很大发发展。展。n n 带带有有pBR322pBR322的大的大肠肠菌素菌素E1(colEl)E1(colEl)复制区。从而复制区。从而赐赐予予宿主菌氨宿主菌氨节节青霉素或卡那霉素抗性。在青霉素或卡那霉素抗性。在这这些些载载体中，体中，编码编码序序列在多克隆位点插入，置于
5、自然列在多克隆位点插入，置于自然T7 RNAT7 RNA聚合聚合酶酶启启动动子子(10(10启启动动子子)或所或所谓谓的的T7 lacT7 lac启启动动子的限制之下，后者是子的限制之下，后者是带带有有laclac操操纵纵子子(larO)(larO)序列的自然序列的自然T7 RNAT7 RNA聚合聚合酶酶启启动动子的衍生体。子的衍生体。laclac阻抑物的阻抑物的结结合能阻断合能阻断转录转录起始。起始。n n将外源基因克隆在含有将外源基因克隆在含有laclac启启动动子的子的pET-30apET-30a表达表达载载体（如体（如图图1 1）中，）中，让让其在其在E.coliE.coli中表达。先
6、中表达。先让让宿主菌生宿主菌生长长，lacIlacI产产生的生的阻遏蛋白与阻遏蛋白与lacIlacI操操纵纵基因基因结结合，从而不能合，从而不能进进行外源基因的行外源基因的转转录录与表达，此与表达，此时时宿主菌正常生宿主菌正常生长长。然后向培育基中加入。然后向培育基中加入laclac操操纵纵子的子的诱导诱导物物IPTG(IPTG(异丙基硫代异丙基硫代-D-D-半乳糖半乳糖)，阻遏蛋白不，阻遏蛋白不能与操能与操纵纵基因基因结结合，合，则则DNADNA外源基因大量外源基因大量转录转录并高效表达，并高效表达，表达蛋白可表达蛋白可经经SDS-PAGESDS-PAGE检测检测。SDS-PAGE分分别别蛋
7、白原理蛋白原理n n组组成蛋白成蛋白质质的氨基酸在确定的氨基酸在确定pHpH的溶液中会的溶液中会发发生解离生解离而而带电带电，带电带电的性的性质质和和带电带电量的多少取决于蛋白量的多少取决于蛋白质质的的性性质质及溶液的及溶液的pHpH值值和离子和离子强强度。度。n n聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶在催化胺凝胶在催化剂过剂过硫酸硫酸铵铵（简简称称ApAp）和加）和加速速剂剂N,N,NN-N,N,NN-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（简简称称TEMEDTEMED）的作用）的作用下，聚合形成三下，聚合形成三维维的网状的网状结结构。蛋白构。蛋白质质在凝胶中受在凝胶中受电电场场的作用而的作用而发发生迁移，不同种蛋白
8、在凝胶的网状生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结结构构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质质所所带电带电荷的荷的多少和蛋白多少和蛋白质质的大小和形的大小和形态态。依据迁移速率的不同，。依据迁移速率的不同，可将不同的蛋白可将不同的蛋白质进质进行分行分别别。n nSDS-PAGE SDS-PAGE 是在蛋白是在蛋白质样质样品中加入品中加入SDSSDS和含有和含有巯巯基基乙醇的乙醇的样样品品处处理液，理液，SDSSDS是一种很是一种很强强的阴离子表面的阴离子表面活性活性剂剂，它可以断开分子内和分子，它可以断开分子内和分子间间的的氢键氢键，破坏蛋，破坏蛋白白质质分子的二分
9、子的二级级和三和三级结级结构。构。n n 强强还还原原剂巯剂巯基乙醇可以断开二硫基乙醇可以断开二硫键键破坏蛋白破坏蛋白质质的四的四级结级结构。使蛋白构。使蛋白质质分子被解聚成分子被解聚成肽链肽链形成形成单链单链分子。分子。解聚后的解聚后的侧链侧链与与SDSSDS充分充分结结合形成合形成带负电带负电荷的蛋白荷的蛋白质质-SDS-SDS复合物。复合物。n n 蛋白蛋白质质分子分子结结合合SDSSDS阴离子后，所阴离子后，所带负电带负电荷的量荷的量远远远远超超过过了它原有的了它原有的净电净电荷，从而消退了不同种蛋白荷，从而消退了不同种蛋白质质之之间间所所带净电带净电荷的差异。蛋白荷的差异。蛋白质质的
10、的电电泳迁移率主要确泳迁移率主要确定于定于亚亚基的相基的相对对分子分子质质量。而与其所量。而与其所带电带电荷的性荷的性质质无无关。关。四试验材料四试验材料五试验步骤五试验步骤1 1目的蛋白的表达目的蛋白的表达（1 1）含外源基因的表达菌株在）含外源基因的表达菌株在LBLB培育基（含培育基（含50g/ml Kana50g/ml Kana）中预培育过夜）中预培育过夜（2 2）按）按1/501/50的比例稀释菌液，于的比例稀释菌液，于250r/min250r/min，培，培育育3 3小时小时,使其使其OD600OD600值达到值达到0.60.6（3 3）加入）加入IPTGIPTG，使其终浓度为，使其
11、终浓度为0.5mmol/L0.5mmol/L（4 4）接着培育）接着培育 小时小时（5 5）取）取1.5ml1.5ml菌液于菌液于10000r/min10000r/min，离心，离心2min2min，收获菌体收获菌体2 2目的蛋白的检测目的蛋白的检测（1 1）凝胶制备）凝胶制备 分别胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分别胶，分别胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分别胶，将分别胶注入玻板后，用去离子水封口，约将分别胶注入玻板后，用去离子水封口，约3040min3040min后凝合。后凝合。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子
12、，胶凝固后即可。（2 2）凝胶电泳）凝胶电泳 取取80 ml 80 ml 电极缓冲液稀释电极缓冲液稀释5 5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V80V恒恒压压2020分钟，分钟，120V120V恒压恒压2 2小时小时 （3 3）染色、脱色）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.51 0.51 小时；之后，在脱色小时；之后，在脱色液中脱色液中脱色1 1小时，视察目的蛋白表达状况。小时，视察目的蛋白表达状况。五留意事项五留意事项n n1 1含外源基因的表达菌株应预培育之后再转接至培含外源基因的表达菌株应预培育之后再转接至培育瓶中，最好不要将菌种干脆接于培育瓶培育，诱导育瓶中，最好不要将菌种干脆接于培育瓶培育，诱导表达。表达。n n2 2表达菌生长至表达菌生长至OD600OD600值值0.60.6左右为诱导适合条件，左右为诱导适合条件，避开菌生长过浓。避开菌生长过浓。n n3 3配制配制SDSSDS胶时应留意充分混匀后加入玻璃板中，胶时应留意充分混匀后加入玻璃板中，并待其充分凝固后运用。并待其充分凝固后运用。思索题思索题1原核表达目的蛋白的基本原理是什么？2SDS-PAGE电泳的原理是什么？