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1、 第十六章第十六章 高效液相色谱法高效液相色谱法 一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件二、流程及主要部件 三、影响分离的因素三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法的主要分离类型四、高效液相色谱法的主要分离类型2023/4/242023/4/24 概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是是2020世纪世纪6060年代末年代末7070年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。手段。2
2、023/4/242023/4/24一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相由两相固定相和流动相组成。固定相和流动相组成。液相液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流；流动相是各种溶剂。动相是各种溶剂。2023/4/242023/4/24被分离混合物由流动相液体推动进入被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中各
3、组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质色谱分离的实质是样品分子（以下称是样品分子（以下称溶质）与溶溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。定色谱过程的保留行为。2023/4/242023/4/24 根据分离机制不同，液相色谱可分根据分离机制不同，液相色谱可分为：为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子
4、排合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型阻色谱等类型。2023/4/242023/4/24它是在经典液相色谱基础上，引入了气它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，相色谱的理论，在技术上在技术上采用了高压泵、采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备备速度快、效率高、灵敏度高、操作自速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点动化的特点。为了更好地了解高效液相。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：色谱法优越性，现从两方面进行比较：2023/4/242023/4/24 高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典
5、液相色谱法的最大优点在于法的最大优点在于高速、高效、高灵敏高速、高效、高灵敏度、高自动化度、高自动化。高速是指在分析速度上。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达最高可达103cmmin-1。高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法2023/4/242023/4/24 例如分离苯的羟基化合物，例如分离苯的羟基化合物，7个组分个组分只需只需1min就可完成。就可完成。对氨基酸分离，用经
6、典色谱法，柱长约对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径柱径0.9cm，流动相速度为流动相速度为30cm3h-1，需用需用20多小时才能多小时才能分离出分离出20种种氨基酸；而用高效液相色谱法，氨基酸；而用高效液相色谱法，只需只需lh之之内即可完成。内即可完成。又如用又如用25cm0.46cm的的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不的柱，采用梯度洗脱，可在不到到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分。个组分。2023/4/242023/4/24 （l l）气相色谱法气相色谱法分析对象分析对象只限于分只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占析气体和沸点较低
7、的化合物，它们仅占有机物总数的有机物总数的2020。对于占有机物总数。对于占有机物总数近近8080的那些高沸点、热稳定性差、摩的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法2023/4/242023/4/24 （2）液相色谱能完成难度较高的分离）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为：工作，因为：气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分
8、子只与固定相相互作用。作用，样品分子只与固定相相互作用。而而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素素。也可选用不同比例的两种或两种以上。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。的液体作流动相，增大分离的选择性。2023/4/242023/4/24 液相色谱固定相类型多，如离子交换色液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。液相色谱通常在室温下操作，
9、较低的液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。温度，一般有利于色谱分离条件的选择。2023/4/242023/4/24（3）由于液体的扩散性比气体的小）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。中，柱外区域扩张可以忽略不计。（4）液相色谱中制备样品简单，回收）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，样品也比较容易，而且回收是定量的，适而且回收是定量的，适合于大量制备合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的
10、。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。2023/4/242023/4/24 目目前前高高效效液液相相色色谱谱法法已已被被广广泛泛应应用用于于分分析析对对生生物物学学和和医医药药上上有有重重大大意意义义的的大大分分子子物物质质，例例如如蛋蛋白白质质、核核酸酸、氨氨基基酸酸、多多糖糖类类、植植物物色色素素、高高聚聚物物、染染料料及及药药物物等等物物质质的的分分离离和分析。和分析。高高效效液液相相色色谱谱法法的的仪仪器器设设备备费费用用昂昂贵贵，操操作作严严格格，这这
11、是是它它的的主主要要缺点缺点。2023/4/242023/4/24 高效液相色谱仪的结构示意见高效液相色谱仪的结构示意见图图20-1，一般可分为，一般可分为4个主要部分：个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统统和检测系统。此外还配有。此外还配有辅助装辅助装置置：如梯度淋洗，自动进样及数据：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。处理等。高效液相色谱仪高效液相色谱仪2023/4/242023/4/242023/4/242023/4/242023/4/242023/4/24 其其工作过程工作过程如下：如下：首先首先高压泵高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器将
12、贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，送入色谱柱，然后然后从控制器的出口从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。液相色谱图。2023/4/242023/4/24高效液相色谱仪高效液相色谱仪1 12023/4/242023/4/24高效液相色谱仪高效液相色谱仪22023/4/242023/4/24高效液相色谱仪高
13、效液相色谱仪3 32023/4/242023/4/24高效液相色谱仪高效液相色谱仪4 42023/4/242023/4/24一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点2023/4/242023/4/241.1.流程流程二、流程及主要部件二、流程及主要部件2023/4/242023/4/242.主要部件：主要部件：（1 1）高压输液泵）高压输液泵：主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010105 5 PaPa应应具具有有压压力力平平稳稳、脉脉冲冲小小、流流量量稳稳定定可可调调、耐腐蚀等特性。耐腐蚀等特性。2023/4/242023/4/24 由于高效液相色谱所用固
14、定相颗粒极由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成阻力器等组成，其中，其中高压输液泵是核心部高压输液泵是核心部件件。2023/4/242023/4/24 对于一个好的高压输液泵应符合密对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂
15、及耐腐蚀调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。等要求。常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。2023/4/242023/4/24 恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，输特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；无关；恒压泵恒压泵是指能保持输出压力恒定，但是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它
16、又分称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复机械注射泵和机械往复泵泵两种，应用最多的是两种，应用最多的是机械往复泵机械往复泵。2023/4/242023/4/24高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约（约5 53030cmcm），），所以所以柱外展宽（又称柱外柱外展宽（又称柱外效应）较突出效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱外展宽可分柱前柱前和和柱后柱后展宽。进样展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素
17、，因此高系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。效液相色谱法中对进样技术要求较严。（2 2）进样系统）进样系统2023/4/242023/4/24流路中为高压力工作状态，通常使用耐流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：进样装置进样装置2023/4/242023/4/24 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括括柱管柱管与与固定相固定相两部分。柱管材料有玻璃、两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属。玻璃管
18、耐压有限，故金属管用得他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。较多。一般色谱柱长一般色谱柱长5 53030cmcm，内径为内径为4 45 5mmmm，凝胶色谱柱内径凝胶色谱柱内径3 31212mmmm，制备柱内制备柱内径较大，可达径较大，可达2525mm mm 以上。以上。（3 3）分离系统）分离系统色谱柱色谱柱2023/4/242023/4/24 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再固定相饱和，使它
19、在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。受影响。2023/4/242023/4/24 柱子装填得好坏对柱效影响很大。柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（对于细粒度的填料（20m）一般采一般采用用匀浆填充法装柱匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。备用。2023/4/242023/4/24柱体为直型不锈钢管，柱体为直型不锈钢管，发展趋势发展趋势是减小填是减小填料粒度和柱径以提高
20、柱效。料粒度和柱径以提高柱效。高效分离柱高效分离柱2023/4/242023/4/24作用作用用来连续监测经色谱柱分离后用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。的流出物的组成和含量变化的装置。在液相色谱中，有两种基本类型的在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是检测器。一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对被，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测紫外、荧光、电化学检测器器等。等。（4 4）检测系统）检测系统2023/4/242023/4/24 另一类是另一类是总体检测器总体检测器
21、，它对试它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有响应，属于这类检测器的有示差折示差折光，电导检测器光，电导检测器等。等。现将常用的检测器介绍如下现将常用的检测器介绍如下:2023/4/242023/4/24目前最常用的检测器主要有：目前最常用的检测器主要有：紫外紫外-可见检测器可见检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器质谱检测器质谱检测器2023/4/242023/4/24v1.1.紫外紫外-可见检测器可见检测器检测室检测室光源光源光栅光栅二极管阵二极管阵列检测器列检测器2023/4/242023/4
22、/24 紫紫外外光光度度检检测测器器（UV）：最最小小检检测测量量10-9gmL-1，对对流流量量和和温温度度的的波波动动不不敏敏感，可用于梯度洗脱。感，可用于梯度洗脱。2023/4/242023/4/24v2.荧光检测器荧光检测器许多有机化合物，特别是芳香族化合许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，物、被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。发射出较激发光波长要长的荧光。特点特点：有非常高的灵敏度和良好的选择有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高性，灵敏度要比紫外检测法高2 3个数量级，个数量级，特别适合于药物和生物化学样品
23、的分析。特别适合于药物和生物化学样品的分析。2023/4/242023/4/24荧光检测器结构示意图荧光检测器结构示意图光源光源检测检测器器滤光片滤光片检测室检测室2023/4/242023/4/24v3.3.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器适合于无紫外吸蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。收、无电活性和不发荧光的样品的检测。2023/4/242023/4/24v4.4.电化学检测器（电化学检测器（以电导检测器为例以电导检测器为例）电导仪电导仪电极电极电极电极2023/4/242023/4/24问题问题电导检测器怎样消除流动相电电导检测器怎样消除流
24、动相电导的干扰？导的干扰？例如，采用阳离子交换色谱分例如，采用阳离子交换色谱分离碱金属离子时，通常用离碱金属离子时，通常用HCl作为作为流动相。流动相。2023/4/242023/4/24v5.5.示差折光率检测器示差折光率检测器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种因此差示折光检测器是一种通用型通用型检测器。检测器。灵敏度可达灵敏度可达1010-7-7gcmgcm-3-3。主要主要缺点缺点是对温是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。2023/4/242023/4/242023/4/242023/4/2
25、4(5)(5)附属系统附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中其中梯度淋洗装置梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。尤为重要的附属装置。2023/4/242023/4/24 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 梯度洗脱梯度洗脱就是在分离过程中使就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、从而使流动相的强度、极性、pHpH值值或离子强度相应地变化，达
26、到提高或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。分离效果，缩短分析时间的目的。2023/4/242023/4/24 梯度洗脱装置分为梯度洗脱装置分为两类两类：一类是一类是外梯度装置外梯度装置（又称低压梯（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是另一类是内梯度装置内梯度装置（又称高压（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。合室混合，再输至柱系统。
27、2023/4/242023/4/24梯度洗脱的实质梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的相的强度，来调整混合样品中各组分的k k值，使所有谱带都以最佳平均值，使所有谱带都以最佳平均k k值通过色值通过色谱柱。谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温气相色谱中的程序升温。所不同的是，在。所不同的是，在梯度洗脱中溶质梯度洗脱中溶质k k值的变化是通过溶质的值的变化是通过溶质的极性、极性、pHpH值和离子强度来实现的，而值和离子强度来实现的，而不是不是借改变温度（温度程序）来达到借改变温度（温度程序）来达
28、到。2023/4/242023/4/24在线脱气装置在线脱气装置在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。柱。除在线脱气装置外，目前也采用超声脱除在线脱气装置外，目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。气、真空脱气等方式。脱气不好时有气泡，导致流动相流速脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。不稳定，造成基线飘移，噪音增加。2023/4/242023/4/24在在高高效效液液相相色色谱谱中中,速速率率方方程程中中的的分分子子扩扩散散项项B/U较较小小，可可以以忽忽略略不
29、不计计，而而只只有有两两项，即：项，即：H=A+C u故故液液相相色色谱谱H-u曲曲线线与与气气相相色色谱谱的的形形状状不不同，如图所示：同，如图所示：影响分离的主要因素影响分离的主要因素有流动相的流量、有流动相的流量、性质和极性。性质和极性。三、影响分离的因素三、影响分离的因素2023/4/242023/4/242023/4/242023/4/24流速：流速：流速大于流速大于0.5cm/s时时,Hu曲线是一曲线是一段斜率不大的直线。降段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重
30、要可度和出峰时间的重要可选择参数。选择参数。影响分离的因素影响分离的因素2023/4/242023/4/24 固定相及分离柱固定相及分离柱：气相色谱中的固：气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备非常高的工作，一般很少自行制备。高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相 2023/4/242023/4/24（）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能高效液相色谱固定相
31、以承受高压能力来分类，可分为力来分类，可分为刚性固体和硬胶刚性固体和硬胶两大类。两大类。刚性固体以刚性固体以二氧化硅为基质二氧化硅为基质，可承受，可承受7.7.O10O108 81.O101.O109 9PaPa的高压，可制成直的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。使用的一种固定相。2023/4/242023/4/24 硬胶硬胶主要用于离子交换和尺主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由
32、寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯聚苯乙烯与与二乙烯苯基二乙烯苯基交联而成。可承受压交联而成。可承受压力上限为力上限为3.5108Pa。固定相按孔固定相按孔隙深度分类，可分为隙深度分类，可分为表面多孔型表面多孔型和和全多孔型固定相全多孔型固定相两类。两类。2023/4/242023/4/241.表面多孔型固定相表面多孔型固定相它的它的基体基体是实心是实心玻璃珠玻璃珠，在玻璃球外面，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。表面活性材料表面活性材料为为氧化铝氧化铝的固定相，这类的固定相，这类固定相的
33、多孔层厚度小、孔浅，相对死体积固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。大允许量受限制。2023/4/242023/4/242全多孔型固定相全多孔型固定相它由它由直径为直径为10nm的硅胶微粒凝的硅胶微粒凝聚聚而成。也可由而成。也可由氧化铝微粒凝聚氧化铝微粒凝聚成成全多孔型固定相，全多孔型固定相，这类固定相由于这类固定相由于颗粒很细（颗粒很细（510m）
34、，），孔仍然较孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。量分析。2023/4/242023/4/242023/4/242023/4/24v流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性（1 1）可可显显著著改改变变组组分分分分离离状状况况的的流流动动相相选选择择在在液液相相色色谱谱中中显显得得特特别别重重要要。液液相相色色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2 2）亲亲水水性性固固定定液液常常采采用用疏疏水水性性流流动动相相，即即流流动动相相的的极极性性小小于于固固定定相相的
35、的极极性性，称称为为正正相液液色谱法相液液色谱法，极性柱也称，极性柱也称正相柱正相柱。2023/4/242023/4/24 （3 3）若若流流动动相相的的极极性性大大于于固固定定液液的的极极性性，则则称称为为反反相相液液液液色色谱谱，非非极极性性柱柱也也称称为为反反相相柱柱。组组分分在在两两种种类类型分离柱上的出峰顺序相反。型分离柱上的出峰顺序相反。2023/4/242023/4/24v流动相组成流动相组成流动相按组成不同可分为流动相按组成不同可分为单组分和多组分；单组分和多组分；按极性可分为按极性可分为极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性；按使用方式有按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗
36、。固定组成淋洗和梯度淋洗。常常用用溶溶剂剂:烷烷、四四氯氯化化碳碳、甲甲苯苯、乙乙酸酸乙乙酯酯、乙醇、乙腈、水。乙醇、乙腈、水。采采用用二二元元或或多多元元组组合合溶溶剂剂作作为为流流动动相相可可以以灵灵活活调调节节流流动动相相的的极极性性或或增增加加选选择择性性，以以改进分离或调整出峰时间。改进分离或调整出峰时间。2023/4/242023/4/24（二）流动相（二）流动相 由由于于高高效效液液相相色色谱谱中中流流动动相相是是液液体体，它它对对组组分分有有亲亲和和力力，并并参参与与固固定定相相对对组组分分的的竞竞争争。因因此此，正正确确选选择择流流动动相相直直接接影影响响组分的分离度。对流动
37、相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1 1）溶溶剂剂对对于于待待测测样样品品，必必须须具具有有合合适适的的极性和良好的选择性。极性和良好的选择性。（2 2）溶剂要与检测器匹配。溶剂要与检测器匹配。2023/4/242023/4/24（3 3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。痕量杂质的。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加存在，将使截止波长值增加501OOnm。（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应化学稳定性好。不能选
38、与样品发生反应或聚合的溶剂。或聚合的溶剂。（5 5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。柱或检测器内形成气泡，影响分离。2023/4/242023/4/24 对于紫外吸收检测器，应对于紫外吸收检测器，应注意选用检注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓溶剂的紫外截止波
39、长指当小于截止波所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-220-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。对于折光率检测器，要求选择与组分对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。最高灵敏度。2023/4/242023/4/242023/4/242023/4/24高效液相色谱法的主要分离
40、类型高效液相色谱法的主要分离类型1.1.吸吸附附色色谱谱（液液-固固吸吸附附色色谱谱）：以以固固体体吸吸附附剂剂为为固固定定相相，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝等等，较较常常使使用用的的是是5 51010mm的的硅硅胶胶吸吸附附剂剂。流流动动相相可可以以是是各各种不同极性的一元或多元溶剂。种不同极性的一元或多元溶剂。2.2.分分配配色色谱谱（液液-液液分分配配色色谱谱）：早早期期通通过过在在担担体体上上涂涂渍渍一一薄薄层层固固定定液液制制备备固固定定相相,现现多多为为化化学学键键合合固固定定相相，即即用用化化学学反反应应的的方方法法通通过化学键将固定液结合在担体表面。过化学键将固定液结合在担体表面
41、。2023/4/242023/4/243.3.离离子子交交换换色色谱谱：固固定定相相为为离离子子交交换换树树脂脂，流流动动相相为为无无机机酸酸或或无无机机碱碱的的水水溶溶液液。各各种种离离子子根根据据它它们们与与树树脂脂上上的的交交换换基基团团的的交交换换能力的不同而得到分离。能力的不同而得到分离。4.4.凝凝胶胶色色谱谱（空空间间排排阻阻色色谱谱）：以以凝凝胶胶为为固固定定相相。凝凝胶胶是是一一种种经经过过交交联联的的、具具有有立立体体网网状状结结构构和和不不同同孔孔径径的的多多聚聚体体的的通通称称。如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖等等软软质质凝凝胶胶；多多孔孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质
42、凝胶；硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；2023/4/242023/4/24高效液相色谱法的主要类型及选择（）液一液分配色谱法（）液一液分配色谱法（LLPC）在液在液-液色谱中液色谱中,流动相和固定相都是流动相和固定相都是液体液体,它能适用于各种样品类型的分离和它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。物。2023/4/242023/4/24 1.1.分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是萃取相同，都是根据
43、物质在两种互不相溶根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。效率，从而能分离各种复杂组分。2023/4/242023/4/242.固定相固定相由由于于液液液液色色谱谱中中流流动动相相参参与与选选择择竞竞争争，因因此此，对对固固定定相相选选择择较较简简单单。只只需需使使用用几几种种极极性性不不同同的的固
44、固定定液液即即可可解解决决分分离问题。离问题。例例如如，最最常常用用的的强强极极性性固固定定液液，一一氧氧二二丙丙睛睛，中中等等极极性性的的聚聚乙乙二二醇醇，非非极性极性的角鲨烷等。的角鲨烷等。2023/4/242023/4/24 3.3.流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽可能对流动相的一个基本要求是流动相尽可能不与固定相互溶，而且不与固定相互溶，而且流动相与固定相的流动相与固定相的极性差别越显著越好极性差别越显著越好。根据所使用的流动。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为相和固定相的极性程度，将其分为正
45、相分正相分配色谱和反相分配色谱配色谱和反相分配色谱。2023/4/242023/4/24 如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱极性，称为正相分配色谱，它适用于极性，它适用于极性化合物的分离。其化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出流出，极性大的后流出。如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱极性，称为反相分配色谱。它适用于非极。它适用于非极性化合物的分离，性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱其流出顺序与正相色谱恰好相反恰好相反。2023/4/242023/4/2
46、4 为了更好解决固定液在载体上流失问题。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了产生了化学键合固定相化学键合固定相。它是将各种不同。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，重大作用，可以认为它的出现是液相色谱可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破法的一个重大突破。它是目前应用最广泛。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有的一种固定相。据统计，约有3/43/4以上的分以上的分离问题是在化
47、学键合固定相上进行的。离问题是在化学键合固定相上进行的。2023/4/242023/4/24（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（CBPC）采采用用化化学学键键合合相相的的液液相相色色谱谱称称为为化化学学键键合合相相色色谱谱法法，简简称称键键合合相相色色谱谱。由由于于键键合合固固定定相相非非常常稳稳定定，在在使使用用中中不不易易流流失失，适适用用于于梯梯度度淋淋洗洗，特特别别适适用用于于分分离离容容量量因因子子k值值范范围围宽宽的的样样品品。由由于于键键合合到到载载体体表表面面的的官官能能团团可可以以是是各各种种极极性性的的，因因此此它它适适用用于于种种类类繁繁多样品的分离。多样品的分
48、离。2023/4/242023/4/241.键合固定相类型键合固定相类型用用来来制制备备键键合合固固定定相相的的载载体体，几几乎乎都都用用硅硅胶胶。利利用用硅硅胶胶表表面面的的硅硅醇醇基基(Si一一OH)与与有有机机分分可可成成键键,即即可可得得到到各各种种性性能能的固定相。一般可分的固定相。一般可分三类三类（1）疏疏水水基基团团如如不不同同链链长长的的烷烷烃烃（C8和和C18）和和苯基等；苯基等；（2）极性基团极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3）离离子子交交换换基基团团如如作作为为阴阴离离子子交交换换基基团团的的胺胺基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。基
49、，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。2023/4/242023/4/242.键合固定相的制备键合固定相的制备（l）硅硅酸酸酯酯（Si一一OR）键键合合固固定定相相,它它是是最最先先用用于于液液相相色色谱谱的的健健合合固固定定相相。用用醇醇与与硅醇基发生酯化反应：硅醇基发生酯化反应：Si0HROHSiORH20由由于于这这类类键键合合固固定定相相的的有有机机表表面面是是一一些些单单体体，具具有有良良好好的的传传质质特特性性,但但这这些些酯酯化化过过的的硅硅胶胶填填料料易易水水解解且且受受热热不不稳稳定定，因因此此仅仅适用于不含水或醇的流动相。适用于不含水或醇的流动相。2023/4/242023
50、/4/24（2）SiC或或Si一一N共价键合固定相共价键合固定相制备反应如下：制备反应如下：2023/4/242023/4/24 共价键健合固定相不易水解，并共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使用水溶液时，反应不方便；当使用水溶液时，必必须限制须限制pHpH在在4 48 8范围内。范围内。2023/4/242023/4/24（3）硅烷化（硅烷化（SiOSiC）键合固定相键合固定相制备反应如下：制备反应如下：这类键会固定相具有热稳定好，不易这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶剂的优点。能在吸水，耐有机溶剂的优点。能在7