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1、High Performance Liquid Chromatography（HPLC）高效液相色谱技术与应用高效液相色谱技术与应用主要内容l l酸性和碱性样品酸性和碱性样品l l酸碱平衡与反相保留酸碱平衡与反相保留l l缓冲液的选择缓冲液的选择l lpKapKa与化合物结构的关系与化合物结构的关系l l离子样品反相分离的优化离子样品反相分离的优化l l选择性的控制选择性的控制l l离子对色谱离子对色谱l l保留机制保留机制l l初始实验初始实验l l控制保留值范围和选择性控制保留值范围和选择性l l离子交换色谱离子交换色谱l l离子交换色谱离子交换色谱l l保留机制保留机制l l方法建立方法
2、建立l l硅胶柱硅胶柱酸性样品和碱性样品l l为方便讨论，我们定义为方便讨论，我们定义“离子溶质离子溶质”为在通常为在通常pHpH范围内含范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。l l在在HPLCHPLC分离条件下，离子电荷随分离条件下，离子电荷随pHpH发生变化的化合物简发生变化的化合物简单地称作酸或碱。单地称作酸或碱。l l在反相色谱（在反相色谱（RPCRPC）中，疏水化合物样品的保留值较大。）中，疏水化合物样品的保留值较大。当某种酸（当某种酸（HAHA）或碱（）或碱（B B）发生解离，其疏水性将会大大）发生解离，其疏水性将会大大减弱
3、。因此在减弱。因此在RPCRPC中的保留值中的保留值k k可能下降可能下降10201020倍。倍。几乎所有与几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于相关的保留值变化均发生于pKa值单位的值单位的pH值范围内值范围内缓冲液的选择l l最好先调节缓冲剂的pH，再加入有机溶剂。l l选择具体缓冲剂时，应切记的几种因素：l l缓冲容量缓冲容量l lUVUV吸收度吸收度l l其它性质：溶解度、稳定性、与样品和其它性质：溶解度、稳定性、与样品和/或色谱或色谱柱的相互作用、挥发性、对柱的相互作用、挥发性、对HPLCHPLC系统的腐蚀系统的腐蚀等等缓冲容量l l缓冲容量由缓冲容量由pHpH、缓冲、缓冲剂剂pKa
4、pKa及其浓度决定及其浓度决定l l与样品化合物的情况与样品化合物的情况类似，缓冲剂发生解类似，缓冲剂发生解离的离的pHpH范围为。只有范围为。只有在此在此pHpH范围内缓冲剂范围内缓冲剂才能有效地控制才能有效地控制pHpH值。值。l l1050mM1050mM浓度的缓冲浓度的缓冲剂对剂对RPCRPC分离一般足分离一般足够够pKa与化合物结构的关系l l若不知样品组分的若不知样品组分的pKapKa值，可以通过样品的分子结构估计值，可以通过样品的分子结构估计出。出。较好的流动相pHl l样品中最常见的酸或碱取代基-NH2、-N(CH3)2等、碱性杂环和羧酸（-COOH）基团。l l与pH有关的保
5、留值变化最可能发生于pH36的范围内，不包括烷基胺化合物。l l无论已知还是未知样品，开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相（pH3）哪种HPLC法对离子样品最合适l lRPCRPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点，通常是首先的分离模式。点，通常是首先的分离模式。l l若分离不够理想，还可考虑在流动相中加入离子若分离不够理想，还可考虑在流动相中加入离子对试剂。对试剂。l l在离子对试剂浓度由零变至最大值时，会有在离子对试剂浓度由零变至最大值时，会有RPCRPCIPCIPC保留值的连续变化。所以起初的保留值的连续变化。所以起初的R
6、PCRPC实验实验有助于后面有助于后面IPCIPC分离条件的优化选择。分离条件的优化选择。l l对特殊分离目的，可以考虑从离子对或离子交换对特殊分离目的，可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。色谱开始。优化离子样品的相分离l l离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似，主要离子样品反相分离的方法建立与中性样品有些相似，主要差异为需用：差异为需用：l l经经pHpH缓冲的流动相缓冲的流动相l l硅羟基效应最小的反相柱硅羟基效应最小的反相柱l l当首次开始当首次开始HPLCHPLC方法建立时，并不知道合适的分离是否方法建立时，并不知道合适的分离是否需要改变需要改变pHpH，所以初始实验的流动相，
7、所以初始实验的流动相pHpH3 3最好。最好。l l下一步通过调节流动相强度（下一步通过调节流动相强度（%B%B），以使样品具有合适的），以使样品具有合适的保留值范围保留值范围0.5k200.5k20。l l离子样品不大可能被强保留，很可能获得较宽的离子样品不大可能被强保留，很可能获得较宽的k k值范围。因此方值范围。因此方法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。法建立的最佳方案是初始运行用梯度洗脱。l l梯度选用宽范围（如梯度选用宽范围（如5%5%100%B100%B），必须注意避免高），必须注意避免高%B%B时析出时析出缓冲盐缓冲盐l l调整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降价保留值范围，调
8、整峰间距，即尽量扩大样品的分离度或降价保留值范围，以便进行等度分离。以便进行等度分离。l l最后改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压最后改变柱条件以最好地兼顾分离度、运行时间和柱压选择性的控制l l改变pH是改变分离选择性的最有效方式l lpHpH值变化常常可导致离子化合物值变化常常可导致离子化合物k k值发生值发生1010倍倍或更大的变化。或更大的变化。l l其它可有效改变峰间距的条件是%B、溶剂类型（甲醇、乙腈、THF）、温度、柱类型（C8、C18、苯基、氰基）与缓冲剂浓度。离子对色谱l l离子对和反相HPLC共享有多种特征l l两种分离使用的色谱柱和流动相大致相似，主要区别是离子
9、对色谱（IPC）的流动相中加入了离子对试剂。l l逻辑上，IPC是需进一步改善的RPC分离的一种补充方法保留的基础离子对试剂的浓度离子对试剂的浓度通过改变被固定相吸收的离子对试剂的多少，通过改变被固定相吸收的离子对试剂的多少，有可能将保留过程由反相连续地改变为离子有可能将保留过程由反相连续地改变为离子交换色谱交换色谱当色谱柱吸收的离子对试剂量增大，离子交换保留机制为主，而反相保留机当色谱柱吸收的离子对试剂量增大，离子交换保留机制为主，而反相保留机制为次要制为次要初始实验特殊离子对试剂的选择特殊离子对试剂的选择(强疏水性或弱疏水性强疏水性或弱疏水性)依赖于流动相强度依赖于流动相强度%B特殊问题l
10、 l人工峰人工峰l l尽可能相近地匹配样品溶剂和流动相的组成，增大进尽可能相近地匹配样品溶剂和流动相的组成，增大进样浓度、减小进样体积样浓度、减小进样体积l l缓慢的色谱柱平衡缓慢的色谱柱平衡l l阴离子试剂（如磺酸盐）用阴离子试剂（如磺酸盐）用50-80%50-80%的甲醇水作清洗的甲醇水作清洗剂易于除去。季铵试剂需用剂易于除去。季铵试剂需用50%50%的甲醇缓冲剂进行的甲醇缓冲剂进行清洗。在用新流动相检查保留值重现性之前，应至少清洗。在用新流动相检查保留值重现性之前，应至少用用2020倍体积的清洗溶剂进行清洗。倍体积的清洗溶剂进行清洗。l l较差的峰形较差的峰形l l硅羟基硅羟基l l温度
11、温度离子交换色谱l l离子交换色谱（IEC）可用于包括生物来源的混合物（氨基酸、低聚核苷酸、肽、蛋白质、核酸）、无机盐和一些金属有机化合物l l因为IEC与离子对HPLC保留机制的相似性，许多可用IEC的分离也用IPC也可解决。l l用IEC原因：l l检测限检测限l l制备分离制备分离l l多步分离多步分离保留的基础对于带电荷对于带电荷z的样品离子和一价的反离子，反离子浓度对其保留值的影响的样品离子和一价的反离子，反离子浓度对其保留值的影响可总结为：可总结为：与固定相共价相连的荷电基团决定用于离子交换的色谱柱的特性：阴离子交与固定相共价相连的荷电基团决定用于离子交换的色谱柱的特性：阴离子交换
12、柱带正电荷，阳离子柱带负电荷。阳离子柱用于阳离子的分离，如质子化换柱带正电荷，阳离子柱带负电荷。阳离子柱用于阳离子的分离，如质子化碱；阴离子柱用于阴离子的或酸性样品的分离碱；阴离子柱用于阴离子的或酸性样品的分离固定相用固定相用R（阳离子交换剂）或（阳离子交换剂）或R（阴离子交换剂）表示，样品用（阴离子交换剂）表示，样品用X（阳离（阳离子）或子）或X（阴离子）表示，（阴离子）表示，IEC的保留过程：的保留过程：pH影响l lIEC一般用于酸性或碱性样品。l l阴离子交换色谱分离酸时，pH增大导致样品解离增多，保留值增大，而降低pH在阳离子交换HPLC中有利于碱的保留。（与RPC保留相反）l l改
13、变pH通常是改变选择性的良好办法盐或缓冲剂类型阴离子交换色谱中，不同置换剂的相对强度顺序为：阴离子交换色谱中，不同置换剂的相对强度顺序为：阳离子交换色谱中转换剂强度顺序为：阳离子交换色谱中转换剂强度顺序为：有机溶剂l l与与RPCRPC相同，流动相中加入有机溶剂会导致保留值下降相同，流动相中加入有机溶剂会导致保留值下降色谱柱类型l l离子交换柱可分为离子交换柱可分为4 4种：弱、强阳离子交换剂（种：弱、强阳离子交换剂（WCXWCX、SCXSCX）与弱、强阴离子交换剂（）与弱、强阴离子交换剂（WAXWAX、SAXSAX）l l强离子交换剂带有的离子基团在通常强离子交换剂带有的离子基团在通常pHp
14、H范围（范围（2 2pHpH1212）解离不改变。弱离子交换剂在一定的）解离不改变。弱离子交换剂在一定的pHpH范围将失去电范围将失去电荷及样品的保留能力。荷及样品的保留能力。l l离子交换色谱大多数的应用使用强离子交换剂离子交换色谱大多数的应用使用强离子交换剂方法的建立l l通常很少使用离子交换色谱同时分离样品阴离子和阳离子通常很少使用离子交换色谱同时分离样品阴离子和阳离子l l对于酸性或阴离子化合物，用强阴离子交换柱。对于酸性或阴离子化合物，用强阴离子交换柱。l l对于碱性或阳离子化合物，用强阳离子交换柱对于碱性或阳离子化合物，用强阳离子交换柱l lpHpH6 6用于阴离子交换，用于阴离子
15、交换，pHpH6 6用于阳离子交换用于阳离子交换l l若已知样品的若已知样品的pKapKa值，阴离子交换时，要求值，阴离子交换时，要求pHpHpKapKa，而，而对于阳离子交换，则要求对于阳离子交换，则要求pHpKapHpKal l缓冲剂浓度应比较低，如缓冲剂浓度应比较低，如2 25mM5mM，以避免与样品离子竞，以避免与样品离子竞争保留争保留l l选择选择B B溶剂溶剂l l通过以下几种手段改善分离通过以下几种手段改善分离l l增加温度增加温度l l加入甲醇加入甲醇l l在能降低柱上电荷的在能降低柱上电荷的pHpH下，用弱离子交换剂下，用弱离子交换剂硅胶柱l l“原原”硅胶色谱柱用于硅胶色谱柱用于IECIEC分离强碱性化合物（分离强碱性化合物（pKapKa8 8）。流动）。流动相为相为90%90%甲醇甲醇/（硝酸铵缓冲液（硝酸铵缓冲液pH910pH910），通过改变离子强度或），通过改变离子强度或pHpH来调节保留值。来调节保留值。