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1、基因与基因工程基因与基因工程基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理基因克隆的酶学基础基因克隆的酶学基础基因克隆的载体基因克隆的载体基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定基因的表达与调节基因的表达与调节已讲述的内容已讲述的内容第1页/共65页讲述的内容提纲讲述的内容提纲 真核基因的大肠杆菌表达体系真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体大肠杆菌的表达载体 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达 影响真核基因表达效率的因素影响真核基因表达效率的因素第2页/共65页第一节第一节 真核基因的大肠杆菌表达体真核基因的大肠杆菌表达体系系第3页/共65页1.1.大肠杆菌表达体系大肠杆菌表
2、达体系基因工程的重要目标基因工程的重要目标 制备大量纯化的蛋白质产物制备大量纯化的蛋白质产物因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统目前常用的表达系统目前常用的表达系统 细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等动物细胞等第4页/共65页背景清楚，特别是对其基因工程表达调控的分子机理研背景清楚，特别是对其基因工程表达调控的分子机理研究的比较深入。究的比较深入。安全，且有多种不同的菌株和质粒载体。安全，且有多种不同的菌株和质粒载体。已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。已有许多真核基因
3、在大肠杆菌中实现高效表达。培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量生培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量生产产大肠杆菌表达系统的优越性大肠杆菌表达系统的优越性第5页/共65页p真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续性，含有真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不具备对内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪接的进行加工剪接的能力。能力。p转录信号的不同：真核基因转录的转录信号的不同：真核基因转录的mRNA不具备结合细不具备结合细菌核糖体所必须的菌核糖体所必须的SD序列；细菌的序列；细菌的RNA聚合酶不能识别聚合酶不能识别真核启动子
4、。真核启动子。p真核基因真核基因mRNA 5-端有帽子结构，端有帽子结构，3-端有端有poly(A)尾巴，尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合的能力，从而阻碍正常影响其稳定性及与细菌核糖体结合的能力，从而阻碍正常的转录和翻译。的转录和翻译。真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍第6页/共65页解决方案解决方案将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。从真核细胞中分离完整加工的从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转录合，采用反转录合成成cDNA，并连接到合适的载体上，可以克服内含子问，并连接到合适的载体上，可以克服内含
5、子问题。题。如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，可如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变的方法消除。的方法消除。第7页/共65页p许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程：磷许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程：磷酸化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，因此，表达的酸化、糖基化等，大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶蛋白无法正确折叠，由此产生
6、的三级结构通常是不可溶的，常形成包涵体，无活性。的，常形成包涵体，无活性。p表达的真核蛋白质被细菌的蛋白酶识别并降解。表达的真核蛋白质被细菌的蛋白酶识别并降解。真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍真核基因在大肠杆菌中表达存在许多障碍第8页/共65页2.2.克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件最基本条件：能够进行正常的转录和翻译最基本条件：能够进行正常的转录和翻译 转录：真核基因置于原核启动子的下游转录：真核基因置于原核启动子的下游 3-末端具有转录终止子末端具有转录终止子 翻译：翻译：mRNA分子具有分子具有RBS（ribosome binding site）包括包括AUG或或
7、GUG和与和与16S rRNA 3-末端末端互补的互补的 SD（Shine-Dalgarno）序列。）序列。第9页/共65页另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能维另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。持正常的稳定性。表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子伴大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子伴侣。侣。第10页/共65页第二节第二节 大肠杆菌
8、的表达载体大肠杆菌的表达载体第11页/共65页PSDCDSTTAmprOriRBSStart codonStop codon大肠杆菌表达载体的基本结构特征大肠杆菌表达载体的基本结构特征第12页/共65页1.1.表达载体的基本成分表达载体的基本成分u启动子：影响外源基因的表达水平启动子：影响外源基因的表达水平 使外源基因高水平表达必须具备的条件：使外源基因高水平表达必须具备的条件：强启动子强启动子启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源蛋白启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源蛋白可能对寄主细胞不利。可能对寄主细胞不利。诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物使诱导型启动子：能通
9、过简单的方式使用廉价的诱导物使外源基因获得表达，如外源基因获得表达，如IPTG、温度等。、温度等。第13页/共65页u转录终止子转录终止子上游启动子会抑制下游启动子的转录功能上游启动子会抑制下游启动子的转录功能(启动子封堵作启动子封堵作用用)，因此需要在克隆基因编码区的，因此需要在克隆基因编码区的3-末端接上一个有末端接上一个有效的转录终止子。效的转录终止子。转录终止子能增强转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。质产物的水平。第14页/共65页u翻译起始序列翻译起始序列：决定：决定mRNA的翻译起始效率。的翻译起始效率。未鉴定出其保守结构，只
10、能采取一些方法降低未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA 5-末端二级结构的形成，增加末端二级结构的形成，增加RBS中中A、T含量，碱基定点突变等含量，碱基定点突变等。u增强子增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源：特殊的序列元件，能显著增强外源基因的表达效率。基因的表达效率。第15页/共65页u翻译终止子翻译终止子：必须存在终止密码子。：必须存在终止密码子。构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子(UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。，以阻止核糖体的跳跃现象。大肠杆菌最偏爱的密码子：大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA当为四联核苷
11、酸当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。时，终止效率进一步增强。第16页/共65页2.2.常用的大肠杆菌表达载常用的大肠杆菌表达载体体laclac启动子的表达载体启动子的表达载体阻遏物阻遏物iPOzayRNARNA聚合酶结合区聚合酶结合区阻遏物结合区阻遏物结合区核糖体结合区核糖体结合区乳糖操纵子结构模型第17页/共65页IDNAZYAOPmRNA阻遏蛋白阻遏蛋白pol没有乳糖存在时没有乳糖存在时阻遏基因阻遏基因第18页/共65页mRNA阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖存在时有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录启动转录mRNA乳糖乳糖半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶第19页/共65页nl
12、ac操纵子受操纵子受lac阻遏物的负调节。阻遏物的负调节。n培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，lac阻遏物同操纵单阻遏物同操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。元结合，关闭乳糖操纵子的活动。n培养基中加入乳糖或其它诱导物培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻遏物结时，同阻遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。合，使乳糖操纵子去阻遏。因此，我们可以通过加入因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基因的表达。诱导来实现外源基因的表达。第20页/共65页lac操纵子的控制区，包括操纵子的控制区，包括核糖体核糖体结合区、结合区、RNA聚合酶聚合酶结合区及阻遏物结合区都
13、位于长结合区及阻遏物结合区都位于长203bp的的HaeIII片断上。片断上。203bp的的HaeIII片断含有片断含有lac启动子、操纵单元及启动子、操纵单元及-半半乳糖苷酶的前乳糖苷酶的前8个密码子。个密码子。可以将该片断插入到质粒中，构建含有可以将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质启动子的质粒表达载体。粒表达载体。第21页/共65页这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所有的有的lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的阻遏物都结合掉，使细菌染色体的-半乳糖半乳糖苷酶基因解抑制。苷酶基因解抑制。含有质粒载体（含有质粒载体（lac启动子、操
14、纵单元）的大肠杆菌启动子、操纵单元）的大肠杆菌能够合成能够合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底底物物)的琼脂平板上呈蓝色。的琼脂平板上呈蓝色。这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。第22页/共65页trptrp启动子的表达载体启动子的表达载体第23页/共65页Trp Trp 高时高时 Trp 低时低时 mRNA OPtrpR调节区调节区 结构基因结构基因 RNA RNA聚合酶聚合酶 RNA RNA聚合酶聚合酶 色氨酸操纵子色氨酸操纵子第24页/共65页色氨酸不是作为诱导物，而是作为辅阻遏物结合色氨酸不是作为诱导物，而是作为辅
15、阻遏物结合trp阻阻遏分子。遏分子。被色氨酸激活的被色氨酸激活的trp阻遏分子同操纵单元结合后，就使阻遏分子同操纵单元结合后，就使得得RNA聚合酶失去同聚合酶失去同trp启动子结合的机会，从而关闭启动子结合的机会，从而关闭trp基因的转录。基因的转录。因此，当色氨酸浓度低时，因此，当色氨酸浓度低时，trp基因转录才能开始。基因转录才能开始。第25页/共65页将将trp操纵子插入到质粒载体中，可以构建含有操纵子插入到质粒载体中，可以构建含有trp启动启动子的表达载体。子的表达载体。这种载体转化大肠杆菌后，经这种载体转化大肠杆菌后，经3-吲哚丙烯酸诱导，可使吲哚丙烯酸诱导，可使外源基因获得高效表达
16、。外源基因获得高效表达。该表达载体优点：表达蛋白产量高于该表达载体优点：表达蛋白产量高于lac操纵子表达系操纵子表达系统。统。第26页/共65页P PL L启动子的表达载体启动子的表达载体第27页/共65页来源于来源于 噬菌体，是一种最广泛使用的大肠杆菌表达载噬菌体，是一种最广泛使用的大肠杆菌表达载体的启动子之一。体的启动子之一。受阻遏基因受阻遏基因cI cI编码蛋白的正调控。编码蛋白的正调控。cI cI基因存在一个温度基因存在一个温度敏感突变等位基因，即敏感突变等位基因，即cI857cI857。cI857cI857或存在于大肠杆菌染色体上，或存在于相容性的质或存在于大肠杆菌染色体上，或存在于
17、相容性的质粒分子上。粒分子上。第28页/共65页cI阻遏蛋白在阻遏蛋白在42时失活，因此大肠杆菌在时失活，因此大肠杆菌在42培培养时，养时，PL启动子启动转录；而在启动子启动转录；而在28-30 培养时，培养时，cI阻遏蛋白有活性，使阻遏蛋白有活性，使PL启动子处于抑制状态，转启动子处于抑制状态，转录停止。录停止。利用这一特性，我们只要简单地改变培养温度，就利用这一特性，我们只要简单地改变培养温度，就可以诱导或关闭可以诱导或关闭PL启动子的活性。启动子的活性。将将PL启动子克隆到质粒载体上，可以构建由启动子克隆到质粒载体上，可以构建由PL启动启动子启动的表达载体。子启动的表达载体。第29页/共
18、65页第30页/共65页BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalI XhoI,SacI,HindIII第31页/共65页第三节第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达第32页/共65页1.1.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位细胞质中表达细胞质中表达：易形成包涵体：易形成包涵体包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表达时常发生的一种特殊生理现象。高效表达时常发生的一种特殊生理现象。包涵体形成的理化参数：对包涵体形成的理化参数：对E.coli 80种蛋白研究获得。种蛋白研究
19、获得。电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半半胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。的总数。第33页/共65页分析蛋白质的氨基酸组分可以预测包涵体形成的概率。分析蛋白质的氨基酸组分可以预测包涵体形成的概率。每种氨基酸出现在各种二级结构中的倾向或者频率不每种氨基酸出现在各种二级结构中的倾向或者频率不同。同。例如：例如：Glu(Glu(谷谷aa)aa)主要出现在主要出现在 螺旋中螺旋中 Asp(Asp(天冬天冬aa)aa)和和Gly(Gly(甘甘aa)aa)主要分布在转角中主要分布在转角中
20、 ProPro也常出现在转角中，但一般不会出现在也常出现在转角中，但一般不会出现在 螺螺旋中旋中第34页/共65页第35页/共65页表达蛋白形成包涵体的优缺点：表达蛋白形成包涵体的优缺点：优点：易于分离优点：易于分离 蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白被保护而免受胞内酶的降解 蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害害 缺点：很难恢复生物学活性缺点：很难恢复生物学活性 蛋白质的终产量低蛋白质的终产量低第36页/共65页解决方案：限制包涵体的形成解决方案：限制包涵体的形成 外源基因外源基因与分子伴侣共表达与分子伴侣共表达分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠
21、。分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株 目的：维持有利的氧化还原电位目的：维持有利的氧化还原电位 低温诱导，降低蛋白质的合成速率低温诱导，降低蛋白质的合成速率 与高可溶性的多肽融合表达与高可溶性的多肽融合表达第37页/共65页周质中表达周质中表达优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中蛋白质的降解作用小。周质中蛋白质的降解作用小。条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜条件：需要信号肽的引
22、导，使表达蛋白由细胞内膜转转 运到周质。运到周质。信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。信号肽：有原核的信号肽，也有真核的信号肽。第38页/共65页蛋白转运过程相当复杂蛋白转运过程相当复杂 蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质中。中。如：免疫球蛋白与如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。细胞受体分子结构相似。免疫球蛋白可以在周质中表达。免疫球蛋白可以在周质中表达。T-细胞受体不能在周质中表达。细胞受体不能在周质中表达。第39页/共65页细胞外表达细胞外表达：易
23、于分离纯化，但相当困难。：易于分离纯化，但相当困难。原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白 需跨越两层膜屏障。需跨越两层膜屏障。解决方案：解决方案：利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与与 E.coli分泌型蛋白融合表达。分泌型蛋白融合表达。增加增加E.coli细胞外膜的渗漏性：信号细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。因共表达。第40页/共65页2.2.融合蛋白的表达融合蛋白的表达融合基因的概念：具有来自两个或两个以上
24、不融合基因的概念：具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA体外重组构建的融合基因：体外重组构建的融合基因：外源基因与启动子融合：编码产物不一定是融合蛋白。外源基因与启动子融合：编码产物不一定是融合蛋白。两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、嵌合蛋白。嵌合蛋白。第41页/共65页融合蛋白质配偶体融合蛋白质配偶体u作用：阻止包涵体的形成作用：阻止包涵体的形成 改善蛋白质的折叠性能改善蛋白质的折叠性能
25、限制蛋白酶的酶解限制蛋白酶的酶解 简化蛋白质的检测与纯化程序简化蛋白质的检测与纯化程序u种类：种类：GST、His6、MBP等等第42页/共65页表达融合蛋白的策略表达融合蛋白的策略F用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接后仍保持正确的读码框。与靶基因连接后仍保持正确的读码框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalI XhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0 kbPtacBspMIBalIPstIAlwN IpBR2332 oriMlu IBstE IINar IEcoR VBssH IISt
26、op CodonsIGSTAmpLac IGA ATT CTA GAEco RIXba I第43页/共65页F用融合载体组合表达融合蛋白质：在克隆外源基因时，用融合载体组合表达融合蛋白质：在克隆外源基因时，不用考虑读码框问题。不用考虑读码框问题。第44页/共65页F用用pBR322质粒载体表达融合蛋白质质粒载体表达融合蛋白质 pBR322质粒载体中含有唯一的质粒载体中含有唯一的PstI位点位点用末端脱氧核糖核苷酸转移酶和用末端脱氧核糖核苷酸转移酶和dGTP或或dCTP进行同聚物进行同聚物加尾。加尾。G、C配对，配对，T4 DNA连接酶连接后，总有一部分具有正确连接酶连接后，总有一部分具有正确的
27、读码结构。的读码结构。GGGGGGGGGGGGGGGGCCCCCCCCCCCCCCCC第45页/共65页融合蛋白的纯化：融合蛋白的纯化：利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱。剂，制备亲和层析柱。通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。第46页/共65页第47页/共65页融合蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合融合蛋白的切割：配偶体的存在
28、可能影响融合蛋白的功能。蛋白的功能。方法：方法：化学切割：化学切割：如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，AUG不不是起始密码子时编码，适合链内不含是起始密码子时编码，适合链内不含甲硫氨酸残基的甲硫氨酸残基的多肽的切割。多肽的切割。MetGST外源蛋白第48页/共65页 酶切割：酶切割：如凝血因子如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编，在融合基因之间插入编码码Xa的识别序列，融合蛋白纯化后可用的识别序列，融合蛋白纯化后可用Xa切除大肠切除大肠杆菌的多肽，得到天然的目标蛋白。杆菌的多肽，得到天然的目标蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白第49页/共65页3.3.
29、外源蛋白在大肠杆菌中的稳定外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性性 影响因素：影响因素：蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶解异常蛋白质，包括外源蛋白。酶解异常蛋白质，包括外源蛋白。解决方案：解决方案：外源蛋白在周质或胞外表达外源蛋白在周质或胞外表达 使用蛋白酶缺陷的菌株使用蛋白酶缺陷的菌株 低温培养、与分子伴侣共表达低温培养、与分子伴侣共表达 消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰修饰第50页/共65页结构决定因子：结构决定因子：N-氨基酸性质及内部的氨基酸性质及内部的PEST序序列列N-端法则：端法则：N-端为精
30、端为精aa、赖、赖aa、亮、亮aa、苯丙、苯丙aa、酪、酪aa、色色aa时，蛋白质的稳定性差。时，蛋白质的稳定性差。N-端附近的内部赖端附近的内部赖aa是遍在蛋白质的受体，易受依赖于是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质的蛋白酶降解。遍在蛋白质的蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷、谷aa、丝、丝aa、苏、苏aa的区段，易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加的区段，易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子的蛋白酶的降了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子的蛋白酶的降解。解。第51页/共65页表达部位：周质与胞外所含蛋白酶
31、较少，在这表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达的蛋白不易被降解。些部位表达的蛋白不易被降解。分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正确折叠。白质的正确折叠。一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。不同类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。第52页/共65页第四节第四节 影响真核基因表达效率的因影响真核基因表达效率的因素素第53页/共65页影响因素影响因素：启动子的强度、启动子的强度、DNA转录起始序列转录起始序列 密码子的选择、密码子的选择、mRN
32、A的二级结构的二级结构 转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性 寄主细胞的生理特征等寄主细胞的生理特征等第54页/共65页1.5-UTR1.5-UTR对克隆基因表达效率的影对克隆基因表达效率的影响响v启动子结构的影响：启动子结构的影响：启动子序列具有启动子序列具有2种保守序列，即种保守序列，即-35区区(5-TTGACA)和和-10区区(5-TATAAT)。启动子序列与此越相似，其表。启动子序列与此越相似，其表达能力越强。达能力越强。-35区和区和-10区之间的距离：也是影响克隆基因表达效区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的重要因素。距离越接近率的重要因素。距离越
33、接近17bp，启动子的活性越强，启动子的活性越强。对于某些启动子，对于某些启动子，-35区上游的区上游的10-100bp序列：起上序列：起上游激活物的作用。游激活物的作用。第55页/共65页v启动子与克隆基因之间距离的影响：启动子与克隆基因之间距离的影响：发生发生2-3nt长度的变化，就能显著影响翻译的效率。长度的变化，就能显著影响翻译的效率。与质粒与质粒mRNA 5-端的二级结构有关：端的二级结构有关：SD序列或序列或AUG密码密码子参与子参与mRNA分子的碱基配对会明显降低分子的碱基配对会明显降低mRNA的翻译效的翻译效率。率。要获得良好表达，要获得良好表达，AUG密码子或密码子或SD序列
34、必须处于易接触序列必须处于易接触的部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。的部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。mRNA 5-末端与末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离小于因素，距离小于15nt时，翻译效率会显著下降。时，翻译效率会显著下降。第56页/共65页v提高克隆基因表达效率的方案：提高克隆基因表达效率的方案：建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。上，从重组体中筛选产量最高的克隆。对于表达产物难以测定的基因，可先将其对于表达产物难以测定的基因，可
35、先将其N-端片断与报端片断与报告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报告基因用克隆基因的告基因用克隆基因的C-端片断替换端片断替换，即得到高效表达克隆，即得到高效表达克隆基因的重组质粒。基因的重组质粒。第57页/共65页质粒的拷贝数的影响：质粒的拷贝数的影响：提高表达效率的途径：增加提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。影响的数量。影响mRNA合成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝合成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的
36、拷贝数。数。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失保持抗生素的选择压力保持抗生素的选择压力将质粒分配功能区将质粒分配功能区par克隆到质粒载体上克隆到质粒载体上2.2.质粒的生物学特性对表达效率的影质粒的生物学特性对表达效率的影响响第58页/共65页 对无质粒的细胞进行反选择对无质粒的细胞进行反选择P1cIT1P2外源基因T2转化大肠杆菌菌株转化大肠杆菌菌株溶源性细菌溶源性细菌质粒丢失质粒丢失重组细菌重组细菌 cI cI缺陷的缺陷的 phage phage阻遏物丧失
37、阻遏物丧失细菌死亡细菌死亡溶菌溶菌第59页/共65页3.mRNA3.mRNA转录物的分子特性对表达效率的影响转录物的分子特性对表达效率的影响转录起始序列的影响：转录起始序列的影响：SD序列的影响：起始密码子上游的序列的影响：起始密码子上游的5-10nt，核糖体的结，核糖体的结合位点。与合位点。与16S rRNA互补程度越高，转译的效率越高。互补程度越高，转译的效率越高。SD序列后的序列后的4个碱基的影响：为个碱基的影响：为4A或或4T时转译效率最高，时转译效率最高，为为4C或或4G时效率只有最高转译效率的时效率只有最高转译效率的50%或或25%。起始密码子起始密码子AUG上游三联密码子组成的影
38、响：上游三联密码子组成的影响：UAU或或CUU时转译最有效，时转译最有效，UUC、UCA、AGG时效率下降时效率下降20%。AUG下游密码子碱基组成的影响：如下游密码子碱基组成的影响：如IFN-第第4 4密码子的密码子的第第3 3位碱基改变时，表达水平变化位碱基改变时，表达水平变化3030倍。倍。第60页/共65页mRNA稳定性的影响：稳定性的影响：mRNA分子的相对寿命，分子的相对寿命，对对RNA酶的抵抗力。酶的抵抗力。两类酶参与：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。两类酶参与：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。mRNA的保护元件：的保护元件：5-UTR、3-UTR及茎环结构。及茎环结构。保护元件
39、与外源保护元件与外源mRNA分子融合后起到稳定剂的作用。分子融合后起到稳定剂的作用。mRNA分子的分子的3-末端的基因外回文序列可以阻止其降末端的基因外回文序列可以阻止其降解。解。第61页/共65页4.4.密码子的使用对表达效率的影响密码子的使用对表达效率的影响v密码子偏爱性的影响：密码子偏爱性的影响：61种，只编码种，只编码20种种aa，多，多数数aa具有几个同义密码子。具有几个同义密码子。一种一种aa使用同义密码子的频率不同，称为密码子偏爱性。使用同义密码子的频率不同，称为密码子偏爱性。外源真核基因若富含大肠杆菌罕用密码子，如外源真核基因若富含大肠杆菌罕用密码子，如AGA和和AGG，则很难
40、在大肠杆菌中表达。，则很难在大肠杆菌中表达。将真核基因与编码将真核基因与编码tRNAArg(AGG/AGA)的基因的基因argU共表达，共表达，可使真核基因获得高水平表达。可使真核基因获得高水平表达。第62页/共65页5.5.寄主细胞生理状态对表达效率的影响寄主细胞生理状态对表达效率的影响v生理状态的影响因素：培养基成分、温度、培生理状态的影响因素：培养基成分、温度、培养基中溶解氧的含量等。养基中溶解氧的含量等。调节大肠杆菌生理状态可以减少包涵体的形成：降低培调节大肠杆菌生理状态可以减少包涵体的形成：降低培养温度、使用使细菌生长速度下降的培养基和养温度、使用使细菌生长速度下降的培养基和pHpH值。值。在不同碳源的无机盐培养基中生长的大肠杆菌，拥有的在不同碳源的无机盐培养基中生长的大肠杆菌，拥有的质粒拷贝数会不同，从而影响外源基因的表达量。质粒拷贝数会不同，从而影响外源基因的表达量。第63页/共65页第64页/共65页感谢您的观看！第65页/共65页