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1、关于真核基因在大肠杆菌中的表达(2)现在学习的是第1页，共76页第一节第一节 真核基因的大肠杆菌表达体系真核基因的大肠杆菌表达体系现在学习的是第2页，共76页1.1.大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系n基因工程的重要目标基因工程的重要目标 制备大量纯化的蛋白质产物制备大量纯化的蛋白质产物 因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的因此，要选择能高水平表达异源真核蛋白的表达系统表达系统n目前常用的表达系统目前常用的表达系统 细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺细菌（大肠杆菌）、酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞等乳动物细胞等现在学习的是第3页，共76页背景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理背
2、景清楚，特别是对其基因表达调控的分子机理研究的比较深入。研究的比较深入。安全安全(被被FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物)，且，且有多种不同的菌株和质粒载体。有多种不同的菌株和质粒载体。已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。已有许多真核基因在大肠杆菌中实现高效表达。培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进行批量生产。生产。大肠杆菌表达系统的优越性大肠杆菌表达系统的优越性现在学习的是第4页，共76页p真核基因与原核基因的差别：真核基因与原核基因的差别：编码基因的不连续性，含编码基因的不连续性，含有内含子序列，大肠杆菌不
3、具备对有内含子序列，大肠杆菌不具备对pre-RNA进行加工剪进行加工剪接的能力。接的能力。pmRNAmRNA分子结构的差异：分子结构的差异：真核基因真核基因mRNA 5-mRNA 5-端有帽子端有帽子结构，结构，3-3-端有端有poly(A)poly(A)尾巴，影响其稳定性及与细菌核尾巴，影响其稳定性及与细菌核糖体结合的能力。糖体结合的能力。大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势现在学习的是第5页，共76页现在学习的是第6页，共76页p转录信号的不同：转录信号的不同：真核基因转录的真核基因转录的mRNA不具备结合不具备结合细菌核糖体所必须的细菌核糖体所必须的SD序列；细菌的序列；
4、细菌的RNA聚合酶不聚合酶不能识别真核启动子。能识别真核启动子。大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势现在学习的是第7页，共76页p蛋白质产物的后修饰：蛋白质产物的后修饰：许多真核基因的蛋白质产许多真核基因的蛋白质产物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基化等。物存在翻译后的修饰过程，如磷酸化、糖基化等。大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白无法正大肠杆菌中无此过程，因此，表达的蛋白无法正确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，确折叠，由此产生的三级结构通常是不可溶的，常形成包涵体，无活性。常形成包涵体，无活性。p蛋白酶的降解：蛋白酶的降解：表达的真核蛋白质被细菌的蛋白酶表达的真核
5、蛋白质被细菌的蛋白酶识别并降解。识别并降解。大肠杆菌表达真核基因的劣势大肠杆菌表达真核基因的劣势现在学习的是第8页，共76页解决方案解决方案从真核细胞中分离完整加工的从真核细胞中分离完整加工的mRNA，采用反转录合成，采用反转录合成cDNA，并连接到载体上，以克服内含子问题。，并连接到载体上，以克服内含子问题。如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用如果知道蛋白质的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。化学方法合成不含内含子序列的寡聚核苷酸片断。将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游。对于细菌中能降解真核
6、蛋白的蛋白酶，可以通过突对于细菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通过突变的方法消除。变的方法消除。现在学习的是第9页，共76页2.2.克隆基因正确表达的基本条件克隆基因正确表达的基本条件n最基本条件：能够进行正常的转录和翻译最基本条件：能够进行正常的转录和翻译 转录：真核基因置于原核启动子的下游转录：真核基因置于原核启动子的下游 3-末端具有转录终止子末端具有转录终止子 翻译：翻译：mRNA分子具有分子具有RBS（ribosome binding site）包括包括AUG或或GUG和与和与16S rRNA 3-末端互补末端互补的的SD（Shine-Dalgarno）序列。）序列。现在学习的是第1
7、0页，共76页n另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能另一个重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性维持正常的稳定性表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。表达蛋白被大肠杆菌蛋白酶降解。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子大肠杆菌不可能对所有外源蛋白都存在正确的分子伴侣。伴侣。现在学习的是第11页，共76页第二节第二节 大肠杆菌的表达载体大肠杆菌的表达载体现在学习的是第12页，共76页大肠杆菌表达载体的基本结构特征大肠杆菌表达
8、载体的基本结构特征核糖体结合位点核糖体结合位点启动子启动子转录终止子转录终止子复制复制起点起点现在学习的是第13页，共76页1.1.表达载体的基本成分表达载体的基本成分u启动子（启动子（P P）：影响外源基因的表达水平）：影响外源基因的表达水平 使外源基因高水平表达必须具备的条件：使外源基因高水平表达必须具备的条件：n强启动子强启动子n启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源蛋启动子呈现一种低限的基础转录水平：表达的外源蛋白可能对寄主细胞不利。白可能对寄主细胞不利。n诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物使外诱导型启动子：能通过简单的方式使用廉价的诱导物使外源基因获得表达，如源基因
9、获得表达，如IPTG、温度等。、温度等。现在学习的是第14页，共76页u转录终止子（转录终止子（TTTT）上游启动子会抑制下游启动子的转上游启动子会抑制下游启动子的转录功能录功能(启动子封堵作用启动子封堵作用)，因此需，因此需要在克隆基因编码区的要在克隆基因编码区的3-末端接末端接上一个有效的转录终止子。上一个有效的转录终止子。转录终止子能增强转录终止子能增强mRNA分子的分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。水平。现在学习的是第15页，共76页u翻译起始序列翻译起始序列：决定：决定mRNA翻译起始效率。翻译起始效率。未鉴定出其保守结构，只能采取一些方法降低未鉴定
10、出其保守结构，只能采取一些方法降低mRNA 5-末端二级结构的形成，增加末端二级结构的形成，增加RBS中中A、T含含量，碱基定点突变等量，碱基定点突变等。现在学习的是第16页，共76页现在学习的是第17页，共76页现在学习的是第18页，共76页现在学习的是第19页，共76页现在学习的是第20页，共76页现在学习的是第21页，共76页u增强子增强子：特殊的序列元件，能显著增强外源：特殊的序列元件，能显著增强外源基因的表达效率。基因的表达效率。u翻译终止子翻译终止子：必须存在终止密码子。：必须存在终止密码子。构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子构建表达载体时通常装上全部的三个终止密码子(UA
11、A,UGA,UAG)，以阻止核糖体的跳跃现象。，以阻止核糖体的跳跃现象。大肠杆菌最偏爱的密码子：大肠杆菌最偏爱的密码子：UAA当为四联核苷酸当为四联核苷酸UAAU时，终止效率进一步增强。时，终止效率进一步增强。现在学习的是第22页，共76页2.2.常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体LacLac启动子的表达载体启动子的表达载体T7T7启动子的表达载体启动子的表达载体现在学习的是第23页，共76页 Lac Lac启动子的表达载体启动子的表达载体乳糖操纵子结构模型乳糖操纵子结构模型现在学习的是第24页，共76页nlac操纵子受操纵子受lac阻遏物的负调节。阻遏物的负调节。n培养基中缺乏乳糖
12、或其它诱导物时，培养基中缺乏乳糖或其它诱导物时，lac阻遏物同操阻遏物同操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。n培养基中加入乳糖或其它诱导物培养基中加入乳糖或其它诱导物(IPTG)时，同阻遏物时，同阻遏物结合，使乳糖操纵子去阻遏。结合，使乳糖操纵子去阻遏。因此，我们可以通过加入因此，我们可以通过加入IPTG诱导来实现外源基因的诱导来实现外源基因的表达。表达。现在学习的是第25页，共76页nLac操纵子的控制区，包括操纵子的控制区，包括核糖体核糖体结合区、结合区、RNA聚合酶结合区聚合酶结合区及阻遏物结合区都位于长及阻遏物结合区都位于长203 bp的的HaeIII
13、片断上。片断上。n203 bp的的HaeIII片断含有片断含有Lac启动子、操纵单元及启动子、操纵单元及-半乳糖苷半乳糖苷酶的前酶的前8个密码子。个密码子。n将该片断插入到质粒中，构建含有将该片断插入到质粒中，构建含有lac启动子的质粒表达载启动子的质粒表达载体。体。现在学习的是第26页，共76页n这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所有这种多拷贝质粒中的操纵单元可以把大肠杆菌中所有的的Lac阻遏物都结合掉，使细菌染色体的阻遏物都结合掉，使细菌染色体的-半乳糖苷酶基半乳糖苷酶基因解抑制。因解抑制。n含有质粒载体（含有质粒载体（Lac启动子、操纵单元）的大肠杆菌能够启动子、操纵单元）的大肠
14、杆菌能够合成合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物底物)的琼脂平的琼脂平板上呈蓝色。板上呈蓝色。n这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。这种显色反应可用来快速鉴定阳性克隆。现在学习的是第27页，共76页T7 噬菌体启动子噬菌体启动子：它是来自：它是来自T7噬菌体的启动子，噬菌体的启动子，具有高度的特异性。具有高度的特异性。只有只有T7 RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆聚合酶才能使其启动，故可以使克隆化基因独自得到表达。化基因独自得到表达。T7 RNA聚合酶的效率比大聚合酶的效率比大肠杆菌肠杆菌 RNA聚合酶高聚合酶高5倍左右倍左右 现在学习的是第28页，
15、共76页现在学习的是第29页，共76页第三节第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达现在学习的是第30页，共76页1.1.外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位n细胞质中表达细胞质中表达：易形成包涵体：易形成包涵体n包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效包涵体：由不可溶性蛋白聚集折叠形成，是外源基因高效表达时常发生的一种特殊生理现象。表达时常发生的一种特殊生理现象。n包涵体形成的理化参数：包涵体形成的理化参数：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸的组分、电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基的组分、半胱氨酸的组分、脯氨酸的组分、亲
16、水性和氨基酸残基的总数。脯氨酸的组分、亲水性和氨基酸残基的总数。现在学习的是第31页，共76页表达蛋白形成包涵体的优缺点：表达蛋白形成包涵体的优缺点：优点：易于分离优点：易于分离 蛋白被保护而免受胞内酶的降解蛋白被保护而免受胞内酶的降解 蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害蛋白质没有活性，不会对寄主细胞造成伤害 缺点：很难恢复生物学活性缺点：很难恢复生物学活性 蛋白质的终产量低蛋白质的终产量低现在学习的是第32页，共76页解决方案：限制包涵体的形成解决方案：限制包涵体的形成 外源基因外源基因与分子伴侣共表达与分子伴侣共表达分子伴侣：能够阻止聚合作用而使蛋白质正确折叠。分子伴侣：能够阻止聚合作
17、用而使蛋白质正确折叠。使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株使用硫氧还蛋白缺陷的寄主菌株 目的：维持有利的氧化还原电位目的：维持有利的氧化还原电位 低温诱导，降低蛋白质的合成速率低温诱导，降低蛋白质的合成速率 与高可溶性的多肽融合表达与高可溶性的多肽融合表达现在学习的是第33页，共76页现在学习的是第34页，共76页现在学习的是第35页，共76页现在学习的是第36页，共76页1.稀释复性：稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连变性剂稀释速度太快，不易控制。稀释法主要有一
18、次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。续稀释三种方式。2.透析复性透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法剂去除速度，但可能形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。应用到生产规模。3.超滤复性超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。过程中不可逆
19、的变性。包涵体蛋白复性方法包涵体蛋白复性方法现在学习的是第37页，共76页4.柱上复性柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。其中的凝胶柱复性均是用复性两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。相比不等）。相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达稀释和透析两种方法，色谱柱复
20、性回收率高（高达90%以上）、快速、以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）现在学习的是第38页，共76页5.高蛋白质浓度下的复性高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已
21、先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。现在学习的是第39页，共76页6.添加促进剂的复性方法添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。a、共溶剂：如、共溶剂：如PEG600020000、甘油
22、等、甘油等b、去污剂及表面活性剂：如、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs 等等C、氧化、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加 入氧化入氧化还原体系，如还原体系，如GSH/GSSG 等等d、0.40.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率的折叠效率 e、分子伴侣和折叠酶、分子伴侣和折叠酶 现在学习
23、的是第40页，共76页n周质中表达周质中表达优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。优点：周质中细胞蛋白少，有利于外源蛋白的纯化。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。周质中蛋白质的降解作用小。周质中蛋白质的降解作用小。条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转条件：需要信号肽的引导，使表达蛋白由细胞内膜转 运到周质。运到周质。现在学习的是第41页，共76页蛋白转运过程相当复杂蛋白转运过程相当复杂 蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。蛋白质跨膜过程还与细胞的结构特征有关。即使存在信号肽，也不能保证蛋白正确转运到周质即使存在信号肽，也不能保证
24、蛋白正确转运到周质中。中。如：免疫球蛋白与如：免疫球蛋白与T-细胞受体分子结构相似。细胞受体分子结构相似。免疫球蛋白可以在周质中表达。免疫球蛋白可以在周质中表达。T-细胞受体不能在周质中表达。细胞受体不能在周质中表达。现在学习的是第42页，共76页n细胞外表达细胞外表达：易于分离纯化，但相当困难。：易于分离纯化，但相当困难。原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白原因：细菌细胞有两层膜，即内膜和外膜，表达蛋白 需跨越两层膜屏障。需跨越两层膜屏障。解决方案：解决方案：利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与利用大肠杆菌固有的途径：将外源蛋白与 E.coli分泌型蛋白融合表达。分泌型蛋白融合表达
25、。增加增加E.coli细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、透化细胞外膜的渗漏性：信号肽序列、透化剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。剂、与细菌素释放蛋白或具透化作用的基因共表达。现在学习的是第43页，共76页2.2.融合蛋白的表达融合蛋白的表达融合基因的概念：具有来自两个或两个以融合基因的概念：具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。上不同基因的核苷酸序列的新型基因。DNA体外重组构建的融合基因：体外重组构建的融合基因：两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编两个或以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编码产物为单一的多肽序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、码产物为单一的多肽
26、序列，称为融合蛋白、杂种蛋白、嵌合蛋白。嵌合蛋白。现在学习的是第44页，共76页现在学习的是第45页，共76页现在学习的是第46页，共76页现在学习的是第47页，共76页表达融合蛋白的策略表达融合蛋白的策略F用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接用融合载体表达融合蛋白质：在设计时注意外源基因与靶基因连接后仍保持正确的读码框。后仍保持正确的读码框。BamHI,SmaI,EcoRI,XbaI,NcoI,SalI XhoI,SacI,HindIIIpGEX-KG5.0 kbPtacBspMIBalIPstIAlwN IpBR2332 oriMlu IBstE IINar IEco
27、R VBssH IIStop CodonsIGSTAmpLac IGA ATT CTA GAEco RIXba I现在学习的是第48页，共76页融合蛋白的纯化：融合蛋白的纯化：利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，利用与融合蛋白中的配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱。制备亲和层析柱。通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白被滞留下来，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白被滞留下来，其它蛋白则流出柱外。其它蛋白则流出柱外。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。通过洗脱处理，可回收到纯化的融合蛋白。现在学习的是第49页，共76页现在学习的是第50页，共76页融合
28、蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合蛋白融合蛋白的切割：配偶体的存在可能影响融合蛋白的功能。的功能。方法：方法：化学切割：化学切割：如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，如溴化氰特异切割甲硫氨酸残基，AUG不是起始密不是起始密码子时编码，适合链内不含码子时编码，适合链内不含甲硫氨酸残基的多肽的切割。甲硫氨酸残基的多肽的切割。MetGST外源蛋白现在学习的是第51页，共76页 酶切割：酶切割：如凝血因子如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编码，在融合基因之间插入编码Xa的识别的识别序列，融合蛋白纯化后可用序列，融合蛋白纯化后可用Xa切除大肠杆菌的多肽，得到天然切除大肠杆菌的多肽，得到天然的目标蛋白。的目标
29、蛋白。Ile-Glu-Gly-ArgGST外源蛋白现在学习的是第52页，共76页现在学习的是第53页，共76页3.3.外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性外源蛋白在大肠杆菌中的稳定性 影响因素：影响因素：蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶解异蛋白的酶解作用：细菌细胞的蛋白酶能选择性地酶解异常蛋白质，包括外源蛋白。常蛋白质，包括外源蛋白。解决方案：解决方案：外源蛋白在周质或胞外表达外源蛋白在周质或胞外表达 使用蛋白酶缺陷的菌株使用蛋白酶缺陷的菌株 低温培养、与分子伴侣共表达低温培养、与分子伴侣共表达 消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰消除蛋白酶切割位点、目标蛋白的疏水性修饰现在学习的是第
30、54页，共76页现在学习的是第55页，共76页现在学习的是第56页，共76页现在学习的是第57页，共76页结构决定因子：结构决定因子：N-氨基酸性质及内部的氨基酸性质及内部的PEST序列序列N-端法则：端法则：N-端为精端为精aa、赖、赖aa、亮、亮aa、苯丙、苯丙aa、酪、酪aa、色、色aa时，蛋白质的时，蛋白质的稳定性差。稳定性差。N-端附近的内部赖端附近的内部赖aa是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质的是遍在蛋白质的受体，易受依赖于遍在蛋白质的蛋白酶降解。蛋白酶降解。PEST序列：指真核蛋白中富含脯序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷、谷aa、丝、丝aa、苏、苏aa的区段，易发生胞内降的
31、区段，易发生胞内降解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子的蛋解，该序列的磷酸化作用增加了与钙离子结合，从而促进依赖于钙离子的蛋白酶的降解。白酶的降解。现在学习的是第58页，共76页表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达的表达部位：周质与胞外所含蛋白酶较少，在这些部位表达的蛋白不易被降解。蛋白不易被降解。分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正确折叠。确折叠。一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同类一种分子伴侣的超量表达无法使蛋白正确折叠，不同类型分子伴侣彼此协调参与蛋白质的折叠。型分子伴侣彼此协
32、调参与蛋白质的折叠。现在学习的是第59页，共76页如何提高目的蛋白的可溶性表达如何提高目的蛋白的可溶性表达1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：法实现：a.降低培养温度降低培养温度 b.使用弱启动子使用弱启动子 c.使用低拷贝数的质粒表达载体使用低拷贝数的质粒表达载体 d.降低诱导物的浓度降低诱导物的浓度现在学习的是第60页，共76页2.改变培养基。改变培养基。a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子 b.加入缓冲液保持加入缓冲液保持pH稳定稳定 c.加入加入1%的葡萄糖，抑制的葡萄糖，抑制lac启动子启动子 d.加入山
33、梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因加入山梨糖醇等可以稳定蛋白天然结构的因子子 e.加入乙醇、硫醇等加入乙醇、硫醇等现在学习的是第61页，共76页3.与分子伴侣或折叠酶共表达。与分子伴侣或折叠酶共表达。常用的分子伴侣有：常用的分子伴侣有：GroES-GroEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折叠酶有：常用的折叠酶有：peptidyl prolyl cis/trans isomerases(PPIs)disulfide oxidoreductase(DsbA)and disulfide isomerase(DsbC)protein disulfide isomerase(PDI)现在
34、学习的是第62页，共76页4.分泌表达：使目的蛋白分泌到周质空间。分泌表达：使目的蛋白分泌到周质空间。n周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，周质空间的氧化性的环境有利于二硫键的形成，而胞内则是还原性的。而胞内则是还原性的。n周质空间有折叠酶周质空间有折叠酶DsbA和和DsbC的存在，帮助的存在，帮助蛋白正确折叠。蛋白正确折叠。n周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。周质空间很少有蛋白酶存在，不会被水解。n可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。现在学习的是第63页，共76页5.使用特定的菌株。使用特定的菌株。nAD494,which has a mutatio
35、n in thioredoxin reductase(trxB).nOrigami，a double mutant in thioredoxin reductase(trxB)and glutathione reductase(gor).现在学习的是第64页，共76页6.与可溶性多肽融合表达。与可溶性多肽融合表达。7.表达目的蛋白的一个片段。大于表达目的蛋白的一个片段。大于 70 kDa的蛋的蛋白在大肠杆菌中是很难表达的。白在大肠杆菌中是很难表达的。8.体外去折叠，重新折叠。体外去折叠，重新折叠。现在学习的是第65页，共76页第四节第四节 影响真核基因表达效率的因素影响真核基因表达效率的因素现
36、在学习的是第66页，共76页n影响因素影响因素：启动子的强度、启动子的强度、DNA转录起始序列转录起始序列 密码子的选择、密码子的选择、mRNA的二级结构的二级结构 转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性转录的终止、质粒的拷贝数及稳定性 寄主细胞的生理特征等寄主细胞的生理特征等现在学习的是第67页，共76页1.5-UTR1.5-UTR对克隆基因表达效率的影响对克隆基因表达效率的影响v启动子结构的影响：启动子结构的影响：启动子序列具有启动子序列具有2种保守序列，即种保守序列，即-35区区(5-TTGACA)和和-10区区(5-TATAAT)。启动子序列与此越相似，其表达能力越强。启动子序列与此越相似，
37、其表达能力越强。-35区和区和-10区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的重要区之间的距离：也是影响克隆基因表达效率的重要因素。距离越接近因素。距离越接近17bp，启动子的活性越强，启动子的活性越强。对于某些启动子，对于某些启动子，-35区上游的区上游的10-100bp序列：起上游激活物序列：起上游激活物的作用。的作用。现在学习的是第68页，共76页v启动子与克隆基因之间距离的影响：启动子与克隆基因之间距离的影响：发生发生2-3nt长度的变化，就能显著影响翻译的效率。长度的变化，就能显著影响翻译的效率。与质粒与质粒mRNA 5-端的二级结构有关：端的二级结构有关：SD序列或序列或AUG密码子
38、参与密码子参与mRNA分分子的碱基配对会明显降低子的碱基配对会明显降低mRNA的翻译效率。的翻译效率。要获得良好表达，要获得良好表达，AUG密码子或密码子或SD序列必须处于易接触的部位，以利于与核序列必须处于易接触的部位，以利于与核糖体结合起始翻译过程。糖体结合起始翻译过程。mRNA 5-末端与末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离小于序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离小于15nt时，翻译效率会显著下降。时，翻译效率会显著下降。现在学习的是第69页，共76页v提高克隆基因表达效率的方案：提高克隆基因表达效率的方案：建立克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置上，建立
39、克隆库：使目的基因放置在与启动子不同距离的位置上，从重组体中筛选产量最高的克隆。从重组体中筛选产量最高的克隆。对于表达产物难以测定的基因，可先将其对于表达产物难以测定的基因，可先将其N-端片断与报告基因融端片断与报告基因融合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来筛选克隆基因有合，再建立克隆库，通过报告基因产物的活性来筛选克隆基因有效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报告基因用克隆基因的效表达的重组菌落。最后将该质粒中的报告基因用克隆基因的C-端片断替换端片断替换，即得到高效表达克隆基因的重组质粒。，即得到高效表达克隆基因的重组质粒。现在学习的是第70页，共76页质粒的拷贝数的影响：质粒的拷贝数
40、的影响：提高表达效率的途径：增加提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。影响的数量。影响mRNA合成速率合成速率的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。的因素有两种，即启动子的强度和基因的拷贝数。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。提高基因的拷贝数：将其克隆到高拷贝数的质粒载体上。质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失质粒的不稳定性的影响：发生质粒丢失保持抗生素的选择压力保持抗生素的选择压力将质粒分配功能区将质粒分配功能区par克隆到质粒载体上克隆到质粒载体上2.2.质粒的生物学特性对表达效率的影响质粒的生物学特性对表达效率的影响现在学习的是第71页，共76页3.mRNA3.mR
41、NA转录物的分子特性对表达效率的影响转录物的分子特性对表达效率的影响转录起始序列的影响：转录起始序列的影响：SD序列的影响：起始密码子上游的序列的影响：起始密码子上游的5-10nt，核糖体的结合位点。，核糖体的结合位点。与与16S rRNA互补程度越高，转译的效率越高。互补程度越高，转译的效率越高。SD序列后的序列后的4个碱基的影响：为个碱基的影响：为4A或或4T时转译效率最高，为时转译效率最高，为4C或或4G时效率只有最高转译效率的时效率只有最高转译效率的50%或或25%。起始密码子起始密码子AUG上游三联密码子组成的影响：上游三联密码子组成的影响：UAU或或CUU时转译时转译最有效，最有效
42、，UUC、UCA、AGG时效率下降时效率下降20%。AUG下游密码子碱基组成的影响：如下游密码子碱基组成的影响：如IFN-第第4 4密码子的第密码子的第3 3位碱位碱基改变时，表达水平变化基改变时，表达水平变化3030倍。倍。现在学习的是第72页，共76页mRNA稳定性的影响：稳定性的影响：mRNA分子的相对寿命，对分子的相对寿命，对RNA酶的抵抗力。酶的抵抗力。两类酶参与：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。两类酶参与：核糖核酸内切酶和核糖核酸外切酶。mRNA的保护元件：的保护元件：5-UTR、3-UTR及茎环结构。及茎环结构。保护元件与外源保护元件与外源mRNA分子融合后起到稳定剂的作用。分子
43、融合后起到稳定剂的作用。mRNA分子的分子的3-末端的基因外回文序列可以阻止其降解。末端的基因外回文序列可以阻止其降解。现在学习的是第73页，共76页4.4.密码子的使用对表达效率的影响密码子的使用对表达效率的影响v密码子偏爱性的影响：密码子偏爱性的影响：61种，只编码种，只编码20种种aa，多数，多数aa具具有几个同义密码子。有几个同义密码子。一种一种aa使用同义密码子的频率不同，称为密码子偏爱性。使用同义密码子的频率不同，称为密码子偏爱性。外源真核基因若富含大肠杆菌罕用密码子，如外源真核基因若富含大肠杆菌罕用密码子，如AGA和和AGG，则很难，则很难在大肠杆菌中表达。在大肠杆菌中表达。将真
44、核基因与编码将真核基因与编码tRNAArg(AGG/AGA)的基因的基因argU共表达，可使真核共表达，可使真核基因获得高水平表达。基因获得高水平表达。现在学习的是第74页，共76页5.5.寄主细胞生理状态对表达效率的影响寄主细胞生理状态对表达效率的影响v生理状态的影响因素：培养基成分、温度、培养基中溶解生理状态的影响因素：培养基成分、温度、培养基中溶解氧的含量等。氧的含量等。调节大肠杆菌生理状态可以减少包涵体的形成：降低培养温度、调节大肠杆菌生理状态可以减少包涵体的形成：降低培养温度、使用使细菌生长速度下降的培养基和使用使细菌生长速度下降的培养基和pHpH值。值。在不同碳源的无机盐培养基中生长的大肠杆菌，拥有的质粒拷贝数会在不同碳源的无机盐培养基中生长的大肠杆菌，拥有的质粒拷贝数会不同，从而影响外源基因的表达量。不同，从而影响外源基因的表达量。现在学习的是第75页，共76页感谢大家观看现在学习的是第76页，共76页