《酶的定向进化.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶的定向进化.ppt（18页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 酶的定向进化 主要内容一 酶定向进化的概念二 酶定向进化的基本过程三 基于易错PCR的黄曲酶毒素解毒酶体外分子 定向进化概念 酶定向进化：是模拟自然进化过程（随机突变、基因重组和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程随机突变、构建突变基因文库、定向选择常用的随机突变方法1 易错PCR技术（error-prone PCR）2 DNA重排技术（DNA shuffling）交错延伸PCR技术(StEP)随机引物体外重组技术(RPR)3 基因家族重排技术(DNA family
2、shuffling）常用的高通量筛选技术1 平板筛选法2 荧光筛选法3 噬菌体表面展示法4 细胞表面展示法5 核糖体表面展示法实验 基于易错PCR的黄曲霉毒素解毒酶体外分子 定向进化结果突变酶A1773：耐高温70突变酶A1476：pH4.0稳定性突变酶A2863：pH4.0和pH7.5稳定性易错易错PCRPCR技术技术 定义：定义：从单一基因出发，通过从单一基因出发，通过改变改变PCRPCR反应条件反应条件，在基，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。过程：过程：双链双链DNADNA变性（解链；变性（解链；85859595）引物与单链
3、引物与单链DNADNA结合（退火；结合（退火；50507070 ）引物延伸（半保留复制；引物延伸（半保留复制；70707575 ）条件：条件：增加增加MgMg2 2（稳定非互补的碱基对）（稳定非互补的碱基对）添加添加MnMn2 2（降低聚合酶的特异性）（降低聚合酶的特异性）4 4种底物的浓度不平衡（种底物的浓度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP)dATP/dTTP/dCTP/dGTP)易错PCR反应体系（20 L）:10PCR 缓冲液2L dATP(10 mmol/L)和dGTP(10 mmol/L)各0.4 L，dCTP(10 mmol/L)和dTTP(10 mmol/L)各2
4、L 模板pKLAC1-adtz 0.2 L 上下游引物(10 mol/L)各0.6 L MgCl2(25 mmol/L)4.4 L MnCl2(2 mmol/L)0、0.8、2、4、6、8 L Taq DNA 聚合酶0.2 L ddH2O 8、6、4、2、0.8、0 L 易错PCR突变文库的建立限制性内切酶：Xho和Not载体：大肠杆菌-酿酒酵母穿梭分泌表达载体pYES2CT-factor(简写为pYC)连接酶：T4DNA连接酶宿主菌：大肠杆菌DH5感受态细胞 酿酒酵母S.cerevisiae BJ5465感受 态细胞 辣根过氧化物酶（HRP）-隐性亮绿（RBG）系统 黄曲霉毒素（AFB1）2O2 2O2+隐性亮绿亮绿谢谢！