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1、酶定向进化第1页，本讲稿共32页天然酶的局限 v天然酶的稳定性差天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低活性低使催化效率很低,还还缺乏有商业价值的催化功能缺乏有商业价值的催化功能v天然酶的局限性源于酶的自然进化过程天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.第2页，本讲稿共32页现代生物工程的要求现代生物工程的要求 v能具备长期稳定性和活性能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料料v如何利用相对
2、简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景.第3页，本讲稿共32页v1993年年,美国科学家美国科学家Arnold F H首先提出酶分首先提出酶分子的定向进化的概念子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶构建新的非天然酶.第4页，本讲稿共32页酶分子定向进化酶分子定向进化v简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。第5页，本讲稿共32页酶定向进化的基本过程v随机突变、构建突变基因
3、文库、定向选择v酶定向进化的基本过程：酶基因酶基因随机突变随机突变构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶反复进行反复进行第6页，本讲稿共32页第一节第一节 酶定向进化的特点酶定向进化的特点 1.1.适应面广适应面广v不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。2.2.目的性强目的性强 3.3.效果显著效果显著第7页，本讲稿共32页第二节第二节 酶基因的随机突变酶基因的随机突变v体外随机突变的方法：体外随机突变的方法：PCRPCR技术、技术、DNADNA重排重排技术、基因家族重排技术技术、基因家族重排技术v基因随机突变方法的特点基因随机突变方
4、法的特点P207P207表表8 81 1第8页，本讲稿共32页一 易错PCR技术第9页，本讲稿共32页v可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变锰离子、改变4 4种底物（种底物（dAMPdAMP、dTMPdTMP、dCMPdCMP、dGMPdGMP）的浓度比等反应条件，使）的浓度比等反应条件，使DNADNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。对错误的出现频率，而引起基因突变。第10页，本讲稿共32页特点v正突变的概率低，突变基因文库较大，文库正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛
5、选的工作量大，一般适用于较小基因的定筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。向进化。第11页，本讲稿共32页实例v枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。vChen 等采用易错PCR 对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP 的浓度,对编码该酶从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行易错PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)中酶活性明显提高v突变体PC3 在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化,得到的突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。第12页，本讲稿共32页二二 DNAD
6、NA重排技术重排技术v概念：又称为概念：又称为DNADNA改组技术，是从正突变改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源基因文库中分离得到的同源DNADNA，用酶切，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次割成随机片断，经过不加引物的多次PCRPCR循循环，使环，使DNADNA的碱基序列重新排布而引起基的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。因突变的技术过程。第13页，本讲稿共32页DNA重排技术的基本过程重排技术的基本过程两条以上正突变基因两条以上正突变基因DNA随机片断随机片断突变基因突变基因构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶酶
7、切酶切（反复进行）（反复进行）无引物无引物PCR基因重组基因重组酶切酶切第14页，本讲稿共32页第15页，本讲稿共32页三基因家族重排技术三基因家族重排技术v又称为基因家族改组技术，是从基因家族又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶的若干同源基因出发，用酶(DNase)(DNase)切割切割成随机片断，经过不加引物的多次成随机片断，经过不加引物的多次PCRPCR循环，循环，使使DNADNA的碱基序列发生重新排布而引起基的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。因突变的技术过程。第16页，本讲稿共32页基因家族重排技术的基本过程基因家族重排技术的基本过程基因家族若干同
8、源基因基因家族若干同源基因酶切酶切DNA随机片断随机片断突变基因突变基因突变基因文库突变基因文库基因重组基因重组筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶无引物无引物PCR酶切酶切反复进行反复进行第17页，本讲稿共32页DNADNA家族重排技术与家族重排技术与DNADNA重排技术的异同点重排技术的异同点v相同点：相同点：DNADNA家族重排技术与家族重排技术与DNADNA重排技术的过程大致重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCRPCR等步骤以等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高获得突变基因，然后经过构建
9、突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。通量筛选技术筛选获得正突变基因。v不同点：不同点：DNADNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行发进行DNADNA序列的重新排布，而后者则从采用易错序列的重新排布，而后者则从采用易错PCRPCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNADNA序序列的重新排布。列的重新排布。第18页，本讲稿共32页第三节第三节 酶突变基因的定向选择酶突变基因的定向选择v突变基因的定向选择基本过程突变基因的定向选择基本过程突变基因突变基因基因载体基因载体突变基因文库突
10、变基因文库基因重组基因重组筛选筛选目的基因目的基因第19页，本讲稿共32页一、构建突变基因文库的主要过程一、构建突变基因文库的主要过程v载体的选择载体的选择1 1）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链DNADNA分子。分子。2 2）噬菌体）噬菌体DNADNA载体：由噬菌体载体：由噬菌体DNADNA改造而成的具有自我复改造而成的具有自我复制能力的载体。制能力的载体。3 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有）黏粒载体：是一类人工构建的含有DNADNA黏性末端和质黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4 4
11、）噬菌粒载体：是一类人工构建的由）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13M13噬菌体单链噬菌体单链DNADNA的的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。第20页，本讲稿共32页基因重组基因重组在体外通过在体外通过DNADNA连接酶的作用，将基因与载体连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组连接在一起形成重组DNADNA的技术过程。的技术过程。黏性末端连接黏性末端连接平头末端连接平头末端连接修饰末端连接修饰末端连接第21页，本讲稿共32页形成基因文库形成基因文库将重组将重组DNADNA转入受体细胞或包装成有感染活性转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体
12、的过程。的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组质粒载体：转化重组噬菌体重组噬菌体DNADNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组将重组DNADNA进行包装，称为有感染活性的重进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。组噬菌体，而形成基因文库。第22页，本讲稿共32页二、突变基因的筛选二、突变基因的筛选（一）（一）定向选择环境条件的设定定向选择环境条件的设定（1 1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变筛）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。（2 2）如果定向进化的目的
13、是提高）如果定向进化的目的是提高内酰胺酶的活性，内酰胺酶的活性，从而提高对从而提高对内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的在含有一定浓度的内酰胺酶类抗生素的培养基中培养内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高抗生素重组细胞，并在每一次突变筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。的浓度。（二）高通量筛选技术（二）高通量筛选技术P217P217表表8 82 2第23页，本讲稿共32页1.1.平板筛选法平板筛选法v平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。胞生
14、长情况、颜色变化情况、透明圈情况。1 1）依据细胞生长情况筛选突变基因）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pHpH稳稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。面有广泛应用。第24页，本讲稿共32页2 2）依据颜色变化筛选突变基因）依据颜色变化筛选突变基因（1 1）在采用噬菌体）在采用噬菌体DNADNA载体构建突变基因文库时，可以用载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片断（半乳糖苷酶的基因片断（lacZlacZ）插入到）插入到噬菌体噬菌体DNADNA的间隔区
15、域中，当它感染了相应的大肠杆菌的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有宿主细胞时，在含有IPTGIPTG和底物和底物X Xgalgal的平板培养基上的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。可以形成蓝色噬菌斑。（2 2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。第25页，本讲稿共32页3）依据透明圈情况筛选突变基因）依据透明圈情况筛选突变基因 依据透明圈情况筛选突变
16、基因是在平板培养基依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。的透明圈。第26页，本讲稿共32页第27页，本讲稿共32页自自 学学 2.2.荧光筛选法荧光筛选法 3.3.噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法 4.4.酵母细胞表面展示法酵母细胞表面展示法第28页，本讲稿共32页第四节第四节 酶定向进化的应用酶定向进化的应用第29页，本讲稿共32页vP221表表83，总结
17、应用，总结应用一、提高酶的催化效率一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性三、改变酶的底物特异性第30页，本讲稿共32页提高酶分子的催化活力v例如，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对L天冬氨酸酶，进行定向进化研究、以提高催化活力。第31页，本讲稿共32页思考题思考题1 1 何谓酶的定向进化？有何特点？何谓酶的定向进化？有何特点？2 2 酶基因随机突变的三种方法？酶基因随机突变的三种方法？3 3 易错易错PCRPCR技术的概念及其主要过程。技术的概念及其主要过程。4 DNA4 DNA重排技术的概念及其主要过程。重排技术的概念及其主要过程。5 5 基因家族重排技术及其主要过程。基因家族重排技术及其主要过程。第32页，本讲稿共32页