高效液相色谱_2012.pptx

《高效液相色谱_2012.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱_2012.pptx（78页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、会计学1高效液相色谱高效液相色谱_2012主要内容主要内容一、概述一、概述二、基本理论及条件选择二、基本理论及条件选择三、各类高效液相色谱法三、各类高效液相色谱法四、影响分离的因素四、影响分离的因素五、高效液相色谱仪五、高效液相色谱仪六、超效液相色谱技术简介六、超效液相色谱技术简介七、七、HPLC定量分析方法学考察定量分析方法学考察八、八、HPLC应用应用第2页/共78页第一节第一节 概述概述 一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别二、二、HPLC与与GC差别差别三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图四、特点四、特点第3页/共78页一、一、一、一、HPLCHPLCHPLCHPLC与

2、经典与经典与经典与经典LCLCLCLC区别区别区别区别主主要要区区别别：固固定定相相差差别别，输输液液设设备和检测手段备和检测手段1经典经典LC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动相 柱效高（H，n）分析时间大大缩短 可以在线检测第4页/共78页二、二、二、二、HPLCHPLCHPLCHPLC与与与与GCGCGCGC差别差别差别差别相相同同：兼兼具具分分离离和和分分析析功功能能，均可以在线检

3、测均可以在线检测 主主要要差差别别：分分析析对对象象的的差差别别和和流动相的差别流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测高聚物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的

4、用途广泛，占有机物的80%第5页/共78页续前续前续前续前2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体组组分分与与流流动动相相无无亲亲合合作作用用力力，只只与与固定相作用固定相作用 vHPLC：流动相为液体：流动相为液体流流动动相相与与组组分分间间有有亲亲合合作作用用力力，为为提高柱的选择性、提高柱的选择性、改改善善分分离离度度增增加加了了因因素素，对对分分离离起很大作用起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流流动动相相极极性性和和pHpH值值的的选选择择也也对对分分离离起到重要作用起到重要作用 选选用用不不同同比比例例的的两两种种或或两两种种以以上

5、上液体作为流动相液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作：加温操作 HPLC：室室温温；高高压压（液液体体粘粘度度大，峰展宽小）大，峰展宽小）第6页/共78页三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3进样装置进样装置4色谱柱色谱柱分离分离5检测器检测器分析分析6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7记录装置记录装置第7页/共78页续续续续前前前前四、四、HPLCHPLC的特点和应用

6、的特点和应用 “三三高高”“一一快快”“一一广广”高高柱柱效效n=104片片/米米，柱柱效效高高（远远高高于于一一般般LC）高灵敏度高灵敏度高选择性高选择性分析速度快分析速度快应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%有机化合物）有机化合物）第8页/共78页第二节第二节 基本理论和条件选择基本理论和条件选择一、塔板理论一、塔板理论平衡理论平衡理论 二、速率理论二、速率理论 Vander方程方程 三、三、HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择第9页/共78页一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论一、塔板理论第10页/共78页二、速率理论（与二、速率理论（与二、速率理论（与二、速率理论（与

7、GCGCGCGC对比）对比）对比）对比）1.第11页/共78页续续续续前前前前2）涡流扩散项及其影响）涡流扩散项及其影响 next2.讨论：讨论：1）流动相流速对）流动相流速对HPLC板高的影响板高的影响（与（与GC对比）对比）next第12页/共78页图图图图示示示示back第13页/共78页续前续前续前续前3）传质阻抗项及其影）传质阻抗项及其影响响 第14页/共78页图图图图示示示示第15页/共78页三、三、HPLCHPLC法中分离条件法中分离条件的选择的选择1.固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固选粒径小的、分布均匀的球形固定相（定相（dp10m）

8、首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：柱温的选择：选室温选室温250C左右左右第16页/共78页第三节第三节 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（三、化学键合相色谱法（BPC）第17页/共78页一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSCLSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固

9、定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1分离机制：利用溶质分子占据固分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性定相表面吸附活性 中心能力的差异中心能力的差异 分离前提：分离前提：K不等或不等或k不等不等第18页/共78页续续续续前前前前2固定相：与固定相：与LC比，固定相粒径比，固定相粒径不同（不同（17%17%分配色谱分配色谱 硅硅胶失活胶失活载体载体 吸吸附的水附的水固定液固定液第20页/共78页二、液液分配色谱法二、液液分配色谱法（LLCLLC）1分分离离机机制制：利利用用组组分分在在两两相相中中溶解度的差异溶解度的差异2固固定定相相：载载体体+固固定定液液（物物理理或机械

10、涂渍法）或机械涂渍法）缺缺点点：系系统统内内部部压压力力大大，易易流流失，不实用失，不实用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC3正正相相色色谱谱固固定定液液极极性性 流流动相极性动相极性（NLLC）极极性性小小的的组组分分先先出出柱柱，极极性性大大的组分后出柱的组分后出柱 适于分离极性组分适于分离极性组分 反反相相色色谱谱固固定定液液极极性性 固固定定相相极性极性 底底剂剂+有有机机调调节节剂剂（极极性性调调节节剂）剂）例：水例：水 +甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF第24页/共78页续前续前续前续前4流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系：流

11、流动动相相极极性性，洗洗脱脱能能力力，k，组分，组分tR5反反相相洗洗脱脱：强强度度因因子子S，见见P291表表13-5。水的洗脱。水的洗脱 能力为能力为0。6.出出柱柱顺顺序序：极极性性大大的的组组分分先先出出柱柱 极极性性小小的的组组分分后后出出柱柱7适适用用：非非极极性性中中等等极极性性组组分分（HPLC80%问题）问题）第25页/共78页（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱1分分离离机机制制：溶溶质质分分子子与与固固定定相相之间定向作用力、之间定向作用力、诱诱导导力力、或或氢氢键键作作用力用力2固固定定相相：极极性性大大的的氰氰基基或或氨氨基基键合相键合相3流动相：极性小（同流动相

12、：极性小（同LSC）底剂底剂 +有机极性调节剂有机极性调节剂 例例：正正己己烷烷 +氯氯仿仿-甲甲醇醇，氯氯仿仿-乙醇乙醇第26页/共78页续前续前续前续前4流动相极性与流动相极性与k的关系：的关系：流动相极性流动相极性，洗脱能力，洗脱能力，组分，组分tR，k5正相洗脱正相洗脱：溶剂的洗脱能力主要参考极性参数：溶剂的洗脱能力主要参考极性参数P（见（见P290 表表13-3）。）。6.出柱顺序：结构相近组分，出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱极性大的组分后出柱6适用：适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性

13、稍小）分离物质也相似分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等第27页/共78页（四）离子对色谱和离子抑制色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（ion-pair chromatography）2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱(ion-press chromatography)第28页/共78页1 1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（IPCIPC或或或或PICPIC）反反相相色色谱谱中中，在在极极性性流流动动相相中中加加入入离离子子对对试试剂

14、剂，使使被被测测组组分分与其中的反离子形成中性离子对，增加与其中的反离子形成中性离子对，增加k和和tR，以改善分离，以改善分离1）离子对试剂：）离子对试剂：烷基磺酸钠烷基磺酸钠分析碱分析碱 四丁基季胺盐四丁基季胺盐分析酸分析酸2）影响）影响k的因素的因素a与与m的极性有关（同反相色谱）的极性有关（同反相色谱）b与与R的链长有关：的链长有关：R长，极性长，极性小，小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱第29页/共78页2 2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱在在反反相相色色谱谱中中，通通过过加加入入缓缓冲冲溶溶液液调调节节流流动动相相pH值

15、值，抑抑制制组分解离，增加其组分解离，增加其k和和tR，以达到改善分离的目的，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关值有关选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及pH值值 酸性物质酸性物质加入酸加入酸HAc tR，k 碱性物质碱性物质加入碱加入碱NH3H2O tR，k 调节调节pH范围：范围：3.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH3.0 pH3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子3）

16、适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；弱酸；pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物第30页/共78页分离类型选择分离类型选择分离类型选择分离类型选择 第31页/共78页第四节第四节 影响分离的因素影响分离的因素一、分离度一、分离度 二、流动相二、流动相三、洗脱方式三、洗脱方式第32页/共78页1 第33页/共78页续续续续前前前前2对对流流动动相相的的要要求：求：1）与固定液不反应）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的最理想的3）与检测器匹配：）与检测器匹配：UV（常常用用，测测定定波波长长应应大大于于溶剂的截止波长）溶

17、剂的截止波长）荧光，电化学荧光，电化学4）使使用用粘粘度度小小、纯纯度度高高的的流流动动相相（甲醇，乙腈）（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气使用前过滤、脱气第34页/共78页续前续前续前续前 3洗脱方式洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以以固固定定配配比比的的溶溶剂剂系系统统洗洗脱脱组组分（一个泵）分（一个泵）类似类似GC的等温度洗脱的等温度洗脱2）梯度洗脱：）梯度洗脱：在在一一定定分分析析周周期期内内不不断断变变换换流流动相的种类和比例动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）即不断改变其极性（两个泵）适适于于分分析析极极性性差差别别较较大大的的复复杂杂组分组分

18、 类类似似GC的的程程序序升升温温（沸沸程程较较长样品）长样品）第35页/共78页图示图示图示图示第36页/共78页第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第37页/共78页第38页/共78页第39页/共78页HPLC HPLC 仪器示意图仪器示意图第40页/共78页HPLCHPLC的基本流程图的基本流程图流动相 泵色谱柱检测器 泵液分离 检测 记录进样阀进样第41页/共78页1泵泵：恒压泵：流量精度不稳恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用恒流泵：常用2进样装置进样装置 1）隔隔膜膜进进样样（高高分分子子有有机机硅硅胶胶垫垫进样室）进样室）GC系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLC系系

19、统统压压力力太太大大，必必须须停泵进样（早期）停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀）阀进样：不必停泵，六通阀第42页/共78页第43页/共78页 开始分析开始分析开始分析开始分析 废废液液样样品品 淋洗液淋洗液 至分离柱至分离柱进样阀进样阀 样样品品 装装装装样样样样 废废液液 淋洗液淋洗液至分离柱至分离柱 六通六通六通六通阀阀（）（）（）（）样样品品环环第44页/共78页续续续续前前前前3 色色 谱谱 柱柱：直直 径径 46mm,柱柱 长长1030cm 柱柱效效评评价价：色色谱谱系系统统适适应应性性试试验验 R，n，fs（拖拖尾尾因因子）子）柱柱再再生生：维维护护、保保养养、柱柱子子

20、的的冲洗冲洗4检测器检测器 1）紫紫外外检检测测器器：适适于于吸吸收收紫紫外外光光的物质的物质 2）荧荧光光检检测测器器：只只能能分分析析自自身身发发光的物质光的物质 灵敏度高灵敏度高 3）示示差差折折光光检检测测器器：利利用用折折光光率率的差别的差别 灵灵敏敏度度低低，温度要求严格温度要求严格 4）电化学检测器）电化学检测器 5）化学发光）化学发光第45页/共78页第46页/共78页 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器第47页/共78页第48页/共78页第49页/共78页第六节第六节 超

21、效液相色谱技术简介超效液相色谱技术简介（UPLC）第50页/共78页第51页/共78页第52页/共78页第53页/共78页第54页/共78页原有原有HPLC分析需要分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要至少需要65分钟才能完成分钟才能完成 第55页/共78页LC/MS联用可容纳联用可容纳600个色谱个色谱峰峰第56页/共78页第七节第七节 HPLCHPLC定量分析方法学考察定量分析方法学考察n准确度（回收率实验）准确度（回收率实验）n精密度（重复性实验）精密度（重复性实验）n检出限（检出限（3 S/N）n定量限（定量限（10 S/N）n线性范围线性范

22、围（2个数量级）个数量级）n色谱系统适用性实验色谱系统适用性实验n柱效（理论塔板数）柱效（理论塔板数）n分离度分离度n重复性重复性n拖尾因子拖尾因子第57页/共78页第八节第八节 HPLCHPLC的应用的应用 第58页/共78页药物分析药物分析药物分析药物分析第59页/共78页食品分析食品分析第60页/共78页环境分析环境分析环境分析环境分析第61页/共78页农药分析农药分析农药分析农药分析第62页/共78页例题例题在反相色谱中，若以甲醇在反相色谱中，若以甲醇-水为流动相，适水为流动相，适当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和当增加甲醇的比例时，组分的容量因子和保留时间的变化为（保留时间的变化为

23、（）。）。A 样品的样品的k降低，降低，tR降低降低 B 样品的样品的k增加，增加，tR增加增加C 样品的样品的k增加，增加，tR降低降低D 样品的样品的k降低，降低，tR增加增加第63页/共78页例题例题在正相色谱中，若适当增大流动相极性，在正相色谱中，若适当增大流动相极性，则（则（）。）。A 样品的样品的k降低，降低，tR降低降低 B 样品的样品的k增加，增加，tR增加增加C 相邻组分的相邻组分的 增加增加 D 对对 基本无影响基本无影响第64页/共78页例题例题HPLC中的最佳流速中的最佳流速uH与与GC中的最佳流速中的最佳流速uG比较结果是（比较结果是（）A uHuGB uHuGC u

24、H=uG第65页/共78页例题例题用用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若例甲醇一水为流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好的办法是（想使容量因子适当增加，较好的办法是（）。）。A 增加流动相中甲醇的比例增加流动相中甲醇的比例 B 增加流动相中的水的比例增加流动相中的水的比例C 流动相中加人少量流动相中加人少量HAc D 流动相中加人少量的氨水流动相中加人少量的氨水第66页/共78页例题例题在液相色谱中，常用作固定相又可用作键在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（合相基体的物质

25、是（）。）。A 分子筛分子筛 B 硅胶硅胶 C 氧化铝氧化铝 D 活性炭活性炭 第67页/共78页例题例题水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）水在下述（）中洗脱能力最弱（作为底剂）A 正相色谱法正相色谱法B 反相色谱法反相色谱法C 吸附色谱法吸附色谱法D 空间排阻色谱法空间排阻色谱法第68页/共78页例题例题键合相的键合基团的碳链长度增加后（）键合相的键合基团的碳链长度增加后（）A 极性减小极性减小B 极性增大极性增大C 载样量增大载样量增大D 载样量减小载样量减小第69页/共78页例题例题在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选择在分配色谱法及化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用

26、力不不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）同），以改善分离度，主要是（）A 提高分配系数比提高分配系数比B 容量因子增大容量因子增大C 保留时间增长保留时间增长D 色谱柱柱效提高色谱柱柱效提高第70页/共78页例题例题二极管阵列检测器与一般分光光度计的主二极管阵列检测器与一般分光光度计的主要差别是（）要差别是（）A 不需光谱扫描即可获得样品每个组分的不需光谱扫描即可获得样品每个组分的 吸收光谱吸收光谱B 服从服从Lambert-Beer定律定律C 复光照射样品，而后再分光复光照射样品，而后再分光D 信号弱，需要累加信号弱，需要累加第71页/共78页例题例题内标对比法与内标

27、一点法的区别是（）内标对比法与内标一点法的区别是（）A 不需要加内标物不需要加内标物B 不需要校正因子不需要校正因子C 进样量不要准确进样量不要准确第72页/共78页例题例题用反相用反相HPLC测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸测定样品中的芦丁含量，选对氨基苯甲酸为为内标。方法如下：内标。方法如下：准确配制准确配制1 mg/mL浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲浓度的芦丁对照溶液和对氨基苯甲酸对照溶液，精取芦丁对照溶液酸对照溶液，精取芦丁对照溶液2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL，分别置于，分别置于25 mL容量容量瓶中，同时各加入内标溶液瓶中，同时

28、各加入内标溶液2.00 mL，定容。各进样，定容。各进样3次，进样量为次，进样量为10L。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面。得芦丁色谱峰面积和内标物峰面积之比的平均值分别为积之比的平均值分别为1.43、2.86、4.29、5.37和和7.16。精称样品精称样品0.2070 g，溶解，定容于，溶解，定容于100 mL容量瓶中。容量瓶中。精取精取10.00 mL于于25 mL容量瓶中，同时加入内标溶液容量瓶中，同时加入内标溶液2.00 mL，定容。进样量为，定容。进样量为10L，3次进样得芦丁色谱次进样得芦丁色谱峰面积与内标物峰面积之比的平均值为峰面积与内标物峰面积之比的平均值为5.10，计算样，计算

29、样品中芦丁的含量。品中芦丁的含量。第73页/共78页第74页/共78页第75页/共78页本章小结：本章小结：1、掌握高效液相色谱的速率理论表达式，并、掌握高效液相色谱的速率理论表达式，并比较与比较与GC的异同；的异同；2、掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及、掌握液液分配色谱中化学键合相的特点及分类；分类；3、掌握、掌握HPLC仪器组成和主要部件的特点；仪器组成和主要部件的特点；4、熟悉、熟悉HPLC的常用分析模式及色谱条件；的常用分析模式及色谱条件；5、熟悉熟悉HPLC中分离度的影响因素式及分析中分离度的影响因素式及分析条件的选择条件的选择第76页/共78页习题与思考题习题与思考题n思考题思考题P306307 1、2、3、4、5、7、8。n习题习题P307 1、2、3、5、6。第77页/共78页感谢您的观看！感谢您的观看！第78页/共78页