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1、课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离思考思考1 1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以
2、用来分离不同蛋白质。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：2 2、凝胶：、凝胶：一些微小的一些微小的多孔球体多孔球体（内含（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）如葡聚糖、琼脂糖）1 1、概念：、概念：根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质的方法分离蛋白质的方法 当不同的蛋白质通过凝胶时，（当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（路程（），移动速度（），移动速度（），），而（而（）的蛋白质无法进入凝）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能
3、在（胶内部的通道，只能在（）移动，）移动，路程（路程（），移动速度（），移动速度（），相），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快3 3、原理：、原理：4 4、具体过程、具体过程相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个 能够抵制（能够抵制（)对溶液的（对溶液的（）的影响，维持的影响，维持PH PH 基本不变。基本不变。缓冲溶液：缓冲溶液：1 1、作用：、作用：外界的酸或
4、碱外界的酸或碱PHPH值值2 2、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（而成。调节缓冲剂的（）就可以制得）就可以制得（）使用的缓冲液。）使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内3.3.为什么在本实验中实用为什么在本实验中实用缓冲溶液缓冲溶液?在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（常结构和功能，便于观察（
5、红色红色）和材）和材料的科学研究（料的科学研究（活性活性）思考：人体血液中缓冲液思考：人体血液中缓冲液?NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3（三）（三）电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电离子在带电离子在电场电场作用作用下发生下发生迁移迁移的过程。的过程。2.2.原理：原理：许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定核酸等都具有可解离的基团，在一定的的PHPH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带向着与其所带电荷相反电荷相反的的电极
6、移动电极移动。电泳利用了电泳利用了待分离样品待分离样品中各种中各种分子带分子带电性质电性质的差异以及分子本身的大小，形的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.3.类型类型:琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（测定（）通常用通常用 SDSSDS聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的
7、电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异二二 实验操作实验操作-蛋白质的提取和分离：蛋白质的提取和分离：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质的提取和分离：蛋白质的提取和分离：（1）样品处理）样品处理洗涤洗涤红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白释放释放分离分离血红蛋白溶液。血红蛋白溶液。（2）粗分离（透析）粗分离（透析）目的目的步骤步骤a a过程：过程：b b目的：目的：c c原理：原理：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋能使小分子自由进出，而大分透析袋能
8、使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。子保留在袋内。(3)纯化：纯化：（4）纯度鉴定：）纯度鉴定：通过凝胶色谱法将分子量通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。血血液液血血浆浆水分水分其他：其他：血浆蛋白、无机盐、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等磷脂、葡萄糖等血血细细胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多最多）血红血红蛋白蛋白（9090）两个两个 肽链肽链两个两个 一肽链一肽链四个亚铁红四个亚铁红素基团素基团2.2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好用哪种血液来提取血红蛋中，
9、最好用哪种血液来提取血红蛋白？为什么？白？为什么？鸡鸡的的红细胞红细胞具有细胞核，含有具有细胞核，含有DNADNA，便于进行，便于进行DNADNA的提取的提取。人人的的红细胞红细胞无细胞核，结构简单，无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白提取血红蛋白。分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，然后通
10、过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经最后经SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。度鉴定。样品纯化的目的是样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。白的分离过程
11、非常直观，大大简化了实验操作。下列操作正确的是（下列操作正确的是（）A.A.分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B.B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可馏水就可C.C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.D.透析时要用透析时要用20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液，的磷酸缓冲液，透析透析12h12hD下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是处理措施中，正确的是 ()()多多A A采集血样后要高速短时问离心获得血采集血样后要高速短时问离心
12、获得血细胞细胞B B洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C C在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白释放出血红蛋白DD释放血红蛋白后再经过离心，就可以释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来使血红蛋白和其他杂质分离开来 BCD在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是理过程中，分析无误的是 A A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐糖、无机盐B
13、 B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果胞等会沉淀，达不到分离的效果C C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1%0.1%的生理盐水的生理盐水DD透析的目的是去除样品中相对分子质量透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质较小的杂质D D凝胶色谱柱取长为凝胶色谱柱取长为40 cm40 cm，内径为，内径为1 16 6 cmcm，有关说法中，正确的是，有关说法中，正确的是 多多A A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果离的效果B B凝胶色谱柱过高超过凝胶色谱柱过高超过1 m1 m，不影响分离，不影响分离的效
14、果的效果C C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度离度D D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大液，样品的稀释度过大样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面胶面的下面B B加样后，打开下端出口，使样品渗入加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内凝胶床内C C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口出口DD用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A A