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1、 生物分离工程生物分离工程生物分离工程生物分离工程基础实验基础实验基础实验基础实验指导教师：龚小雁指导教师：龚小雁 张秀萍张秀萍第1页/共24页生物分离工程实验生物分离工程实验I基础实验：基础实验：第第11/12周周薄板层析法鉴定四环素成品纯度薄板层析法鉴定四环素成品纯度第第14周周PEG400/(NH4)2SO4两水相系统相图的制作两水相系统相图的制作第第15周周两水相系统中蛋白质分配系数的测定两水相系统中蛋白质分配系数的测定第第16周周离子交换树脂总交换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定第2页/共24页实验内容及时间实验内容及时间u薄板层析法鉴定四环素纯度薄板层析法鉴定四环素纯度 实验
2、一班：第11周 周一，周四 实验二班：第12周 周一，周四u两水相萃取相图制作两水相萃取相图制作 实验一班：第14周 周一 实验二班：第14周 周四u两水相萃取蛋白质分配系数测定两水相萃取蛋白质分配系数测定 实验一班：第15周 周一 实验二班：第15周 周四u离子交换树脂总交换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定 实验一班：第16周 周一 实验二班：第16周 周四第3页/共24页实验时间安排表实验时间安排表周次日期星期时间发酵实验5-212分离实验5-112115月6日星期一13:30实验一班5月9日星期四13:30实验一班125月13日星期一13:30实验二班5月16日星期四13:30实验
3、二班135月20日星期一13:30实验二班5月23日星期四13:30实验一班145月27日星期一13:30实验二班实验一班5月30日星期四13:30实验一班实验二班156月3日星期一13:30实验二班实验一班6月6日星期四13:30实验一班实验二班166月8日星期六13:30实验二班实验一班6月13日星期四13:30实验一班实验二班176月17日星期一13:30实验二班6月20日星期四13:30实验一班第4页/共24页考核方式考核方式 考勤考勤提问和操作提问和操作实验报告：实验报告：预习报告预习报告 实验结果、讨论、思考题实验结果、讨论、思考题第5页/共24页薄板层析法薄板层析法鉴定四环素纯度
4、鉴定四环素纯度第6页/共24页u加深对薄板层析法基本原理的理解。u熟悉薄板层析法的操作过程。u采用薄板层析法来考察四环素制品纯度。一、目的和要求一、目的和要求第7页/共24页（一）层析：色谱 chromatographyu一种分离技术。u任何层析都具有两个相，固定相固定不动，流动相对固定相作相对运动。u不同物质在两相间分配差异，随流动相以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。固定相：固体或液体(固定在载体上)流动相：流过固定相的液体、气体或超临界流体。二、实验原理二、实验原理第8页/共24页（二）层析方法：根据机理可以分为：分配层析吸附层析凝胶层析离子交换层析亲和层析二、实验原理二、实验
5、原理根据层析的方式：纸层析薄层层析柱层析第9页/共24页（三）薄板层析（TLC）u利用不同溶质组分在固定相和流动相的利用不同溶质组分在固定相和流动相的两种液体两种液体中中分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达到分离。达到分离。溶质易分配在固定相中溶质易分配在固定相中 溶质易分配在流动相中溶质易分配在流动相中 二、实验原理二、实验原理移动速度慢。移动速度慢。移动速度快。移动速度快。第10页/共24页利用阻滞因子Rf值来表征各组分的差别移动：0 Rf 1,适宜范围0.20.8二、实验原理二、实验原理 溶质移动距离 同一时间流动相移动距离Rf=
6、第11页/共24页二、实验原理二、实验原理固定相：一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。流动相（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。薄板层析法：支持物:中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过 硅藻土/纤维素/硅胶/氧化铝等，亲水物质能储留水。本实验为硅藻土。本实验为硅藻土。本实本实验为吸附在硅藻土上的验为吸附在硅藻土上的EDTAEDTA缓冲液。缓冲液。本实验为丙酮本实验为丙酮:乙酸乙酯乙酸乙酯:氯仿氯仿=3:1:1=3:1:1 第12页/共24页（四）四环素广谱抗生素广谱抗生素四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差向四环素。
7、差向四环素。四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液体。体。氢化骈四苯环氢化骈四苯环 （含共轭双键，可紫外吸收，荧光（含共轭双键，可紫外吸收，荧光）二、实验原理二、实验原理第13页/共24页本实验所需仪器玻璃板研钵天平移液管硅藻土EDTA缓冲液饱和氯化铵缸+架子uu展层剂展层剂uu展层缸展层缸uu点样毛细管点样毛细管uu小刀和直尺小刀和直尺uu紫外灯紫外灯uu氨水氨水三、主要实验器材与试剂三、主要实验器材与试剂第14页/共24页（一）溶液配制（已配置）1.硅藻土处理：取薄板层析用硅藻土50g，加25ml浓盐酸和250ml水，搅拌煮沸10m
8、in，冷却，过滤，用蒸馏水洗，直至洗液对刚果红指示剂不显颜色，然后用流动相液体洗涤，过滤，105烘箱干燥。2.EDTA缓冲液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，摇匀即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保湿），再加入950ml pH7 0.1M EDTA（鳌合）溶液，混匀即得EDTA缓冲液。3.展 层 剂（流 动 相）：取 pH7 EDTA溶 液 5ml，缓 慢 加 在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展层缸中。4.样 品 配 制：称 取 100mg成 品 四 环 素，溶 于 5ml甲 醇 中 得2%（W/V）溶液。四、实验方法四、实验
9、方法第15页/共24页硅藻土硅藻土 1g 研钵研钵EDTA缓冲液缓冲液2ml蒸馏水蒸馏水0.75ml研匀（颗粒适中、无气泡）研匀（颗粒适中、无气泡）置饱和NH4Cl缸室温放置室温放置无明显水渍无明显水渍厚度涂均匀，厚度涂均匀，特别下边缘涂满平整特别下边缘涂满平整（二）层析操作四、实验方法四、实验方法第16页/共24页第17页/共24页0.5cm15cm1.5cm均匀均匀无气泡无气泡无裂纹无裂纹毛细管点样毛细管点样点点样样点点甲甲醇醇挥挥发发干干后后，将将板板放放入入展层缸内，密封展层缸内，密封晾干，氨气熏，晾干，氨气熏，紫外灯下观察紫外灯下观察分别求两种分别求两种组分的组分的Rf值值量距离量距
10、离展层剂展层剂0.5cmuu样点高于液面样点高于液面 溶质移动距离 同一时间流动相移动距离Rf=第18页/共24页第19页/共24页操作注意点操作注意点制板：1.在研钵中研磨时应缓慢，注意不能产生气泡。2.薄板移入饱和氯化铵的缸中时，不宜太干或太湿，以无明显水渍为宜。太干展层太快，引起拖尾；太湿展层太慢。点样：3.点样时，尽量使点样斑点直径小。4.点样后，待溶剂挥发后再移入展层缸内，不要用电吹风。展层：3.注意展层剂浸没薄层的一端约0.5cm，不能浸没样品斑点。4.层析缸盖子应盖密，减少溶剂挥发。第20页/共24页实验结果和讨论实验结果和讨论（一）预习1.四环素的硅藻土薄板层析属于哪一种层析机制。固定相和流动相分别是什么？2.为了使层析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事项。（二）实验结果和讨论1.在纸上描绘出薄板上斑点的图形，量出各斑点组分的距离，计算Rf值。2.分析实验结果。3.总结本实验成功或失败的经验教训。五、思考题五、思考题第21页/共24页时间安排时间安排星期一：制板 室温晾干 饱和氯化铵缸星期四：点样 展层 显示斑点星期四各组自带小刀和直尺第22页/共24页值日生值日生 第一组 第二组 第三组擦干净实验桌面擦干净实验桌面整理好试剂药品整理好试剂药品扫地、拖地扫地、拖地第23页/共24页感谢您的观看！第24页/共24页