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1、v上上课课前，每前，每组组洗干洗干净净3块块玻璃板、玻璃板、1个研个研钵钵、1根研磨棒，去离子水根研磨棒，去离子水润润洗，洗，放入放入实验实验室后面的烘箱内烘干，室后面的烘箱内烘干，研研钵钵倒扣放置！倒扣放置！v按按组组号号签签到。到。生物分离工程生物分离工程生物分离工程生物分离工程基础实验基础实验基础实验基础实验指导教师：龚小雁指导教师：龚小雁 张秀萍张秀萍生物分离工程实验生物分离工程实验Iv基础实验：基础实验：第第11/12周周薄板层析法鉴定四环素成品纯度薄板层析法鉴定四环素成品纯度第第14周周PEG400/(NH4)2SO4两水相系统相图的制作两水相系统相图的制作第第15周周两水相系统中
2、蛋白质分配系数的测定两水相系统中蛋白质分配系数的测定第第16周周离子交换树脂总交换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定实验内容及时间实验内容及时间u薄板层析法鉴定四环素纯度薄板层析法鉴定四环素纯度 实验实验一班：第一班：第11周周 周一，周四周一，周四 实验实验二班：第二班：第12周周 周一，周四周一，周四u两水相萃取相图制作两水相萃取相图制作 实验实验一班：第一班：第14周周 周一周一 实验实验二班：第二班：第14周周 周四周四u两水相萃取蛋白质分配系数测定两水相萃取蛋白质分配系数测定 实验实验一班：第一班：第15周周 周一周一 实验实验二班：第二班：第15周周 周四周四u离子交换树脂总交
3、换容量的测定离子交换树脂总交换容量的测定 实验实验一班：第一班：第16周周 周一周一 实验实验二班：第二班：第16周周 周四周四实验时间安排表实验时间安排表周次周次日期日期星期星期时间时间发发酵酵实验实验5-212分离分离实验实验5-112115月6日星期一13:30实验一班5月9日星期四13:30实验一班125月13日星期一13:30实验二班5月16日星期四13:30实验二班135月20日星期一13:30实验二班5月23日星期四13:30实验一班145月27日星期一13:30实验二班实验一班5月30日星期四13:30实验一班实验二班156月3日星期一13:30实验二班实验一班6月6日星期四1
4、3:30实验一班实验二班166月8日星期六13:30实验二班实验一班6月13日星期四13:30实验一班实验二班176月17日星期一13:30实验二班6月20日星期四13:30实验一班考核方式考核方式 考勤考勤提问和操作提问和操作实验报告：实验报告：预习报告预习报告 实验结果、讨论、思考题实验结果、讨论、思考题薄板层析法薄板层析法鉴定四环素纯度鉴定四环素纯度u加深对薄板层析法基本原理的理解。加深对薄板层析法基本原理的理解。u熟悉薄板层析法的操作过程。熟悉薄板层析法的操作过程。u采用薄板层析法来考察四环素制品纯度。采用薄板层析法来考察四环素制品纯度。一、目的和要求一、目的和要求（一）层析：（一）层
5、析：色色谱谱 chromatographyu一种分离技术。一种分离技术。u任何层析都具有两个相，任何层析都具有两个相，固定相固定相固定不动，固定不动，流动相流动相对对固定相作相对运动。固定相作相对运动。u不同物质在两相间分配差异，随流动相以不同的速度不同物质在两相间分配差异，随流动相以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。沿固定相移动，最终达到分离的效果。v固定相：固定相：固体固体或或液体液体(固定在载体上固定在载体上)v流动相：流动相：流过固定相的流过固定相的液体、气体或超临界流体液体、气体或超临界流体。二、实验原理二、实验原理（二）层析方法：（二）层析方法：根据机理可以分为：根据机理
6、可以分为：v分配层析分配层析v吸附层析吸附层析v凝胶层析凝胶层析v离子交换层析离子交换层析v亲和层析亲和层析二、实验原理二、实验原理根据层析的方式：根据层析的方式：纸层析纸层析薄层层析薄层层析柱层析柱层析（三）薄板（三）薄板层层析（析（TLC）u利用不同溶质组分在固定相和流动相的利用不同溶质组分在固定相和流动相的两种液体两种液体中分中分配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达配系数不同，展层时形成以不同速度移动的区带，达到分离。到分离。v溶质易分配在固定相中溶质易分配在固定相中 v溶质易分配在流动相中溶质易分配在流动相中 二、实验原理二、实验原理移动速度慢。移动速度慢。移动速度快。移动速
7、度快。v利用利用阻滞因子阻滞因子Rf值值来表征各来表征各组组分的差分的差别别移移动动：0 Rf 1,适宜范适宜范围围0.20.8二、实验原理二、实验原理 溶溶质质移移动动距离距离 同一同一时间时间流流动动相移相移动动距离距离Rf=二、实验原理二、实验原理固定相：固定相：一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。一般为水及各种水溶液、甲酰胺、低级醇等。流动相流动相（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。（展层剂）：与水不溶（或微溶）的有机溶剂。薄板层析法：薄板层析法：支持物支持物:中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过中性、多孔粉末、无吸附活性、流动相自由通过 硅藻土硅藻土/纤维素纤维素/硅
8、胶硅胶/氧化铝等，亲水物质能储留水。氧化铝等，亲水物质能储留水。本实验为硅藻土。本实验为硅藻土。本实验为硅藻土。本实验为硅藻土。本实本实本实本实验为验为验为验为吸附在硅藻土上的吸附在硅藻土上的吸附在硅藻土上的吸附在硅藻土上的EDTAEDTA缓缓缓缓冲液。冲液。冲液。冲液。本本本本实验为实验为实验为实验为丙丙丙丙酮酮酮酮:乙酸乙乙酸乙乙酸乙乙酸乙酯酯酯酯:氯氯氯氯仿仿仿仿=3:1:1=3:1:1（四）四（四）四环环素素v广谱抗生素广谱抗生素v四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差四环素发酵或保管不当时，生成抗菌作用弱，毒性强的差向四环素。向四环素。v四环素易溶于流动相液体，差向四环素
9、易溶于固定相液体。四环素易溶于流动相液体，差向四环素易溶于固定相液体。v氢化骈四苯环氢化骈四苯环 （含共轭双键，可紫外吸收，荧光（含共轭双键，可紫外吸收，荧光）二、实验原理二、实验原理本实验所需仪器v玻璃板玻璃板v研研钵钵v天平天平v移液管移液管v硅藻土硅藻土vEDTA缓缓冲液冲液v饱饱和和氯氯化化铵铵缸缸+架子架子uu展层剂展层剂展层剂展层剂uu展层缸展层缸展层缸展层缸uu点样毛细管点样毛细管点样毛细管点样毛细管uu小刀和直尺小刀和直尺小刀和直尺小刀和直尺uu紫外灯紫外灯紫外灯紫外灯uu氨水氨水氨水氨水三、主要实验器材与试剂三、主要实验器材与试剂（一）溶液配制（一）溶液配制（已配置）（已配置
10、）1.硅硅藻藻土土处处理理：取取薄薄板板层层析析用用硅硅藻藻土土50g，加加25ml浓浓盐盐酸酸和和250ml水水，搅搅拌拌煮煮沸沸10min，冷冷却却，过过滤滤，用用蒸蒸馏馏水水洗洗，直直至至洗洗液液对对刚刚果果红红指指示示剂剂不不显显颜颜色色，然然后后用用流流动动相相液液体体洗洗涤涤，过过滤滤，105烘烘箱干燥。箱干燥。2.EDTA缓缓冲冲液液（固固定定相相）：在在40ml甘甘油油中中，加加入入10ml聚聚乙乙二二醇醇400，摇摇匀匀即即得得20%（V/V）聚聚乙乙二二醇醇400的的甘甘油油溶溶液液（保保湿湿），再再加加入入950ml pH7 0.1M EDTA（鳌鳌合合）溶溶液液，混混匀
11、匀即即得得EDTA缓缓冲液。冲液。3.展展层层剂剂（流流动动相相）：取取pH7 EDTA溶溶液液5ml，缓缓慢慢加加在在200ml（丙丙酮酮:氯氯仿仿:乙酸乙乙酸乙酯酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展）溶液中，然后倒入展层层缸中。缸中。4.样样 品品 配配 制制：称称 取取 100mg成成 品品 四四 环环 素素，溶溶 于于 5ml甲甲 醇醇 中中 得得2%（W/V）溶液。）溶液。四、实验方法四、实验方法硅藻土硅藻土 1g 研钵研钵EDTA缓冲液缓冲液2ml蒸馏水蒸馏水0.75ml研匀（颗粒适中、无气泡）研匀（颗粒适中、无气泡）置置饱饱和和NH4Cl缸缸室温放置室温放置无明显水渍无明显水渍厚度
12、涂均匀，厚度涂均匀，特别下边缘涂满平整特别下边缘涂满平整（二）（二）层层析操作析操作四、实验方法四、实验方法0.5cm15cm1.5cm均匀均匀无气泡无气泡无裂纹无裂纹毛细管点样毛细管点样点点样样点点甲甲醇醇挥挥发发干干后后，将将板板放放入入展层缸内，密封展层缸内，密封晾干，氨气熏，晾干，氨气熏，紫外灯下观察紫外灯下观察分别求两种分别求两种组分的组分的Rf值值量距离量距离展层剂展层剂0.5cmuu样点高于液面样点高于液面样点高于液面样点高于液面 溶溶质质移移动动距离距离 同一同一时间时间流流动动相移相移动动距离距离Rf=操作注意点操作注意点v制板：制板：1.在研在研钵钵中研磨中研磨时应缓时应缓
13、慢，注意不能慢，注意不能产产生气泡。生气泡。2.薄板移入薄板移入饱饱和和氯氯化化铵铵的缸中的缸中时时，不宜太干或太湿，以无明，不宜太干或太湿，以无明显显水水渍为渍为宜。宜。太干展太干展层层太快，引起拖尾；太湿展太快，引起拖尾；太湿展层层太慢。太慢。v点点样样：3.点点样时样时，尽量使点，尽量使点样样斑点直径小。斑点直径小。4.点点样样后，待溶后，待溶剂挥发剂挥发后再移入展后再移入展层层缸内，缸内，不要用不要用电电吹吹风风。v展展层层：3.注意展注意展层剂层剂浸没薄浸没薄层层的一端的一端约约0.5cm，不能浸没不能浸没样样品斑点品斑点。4.层层析缸盖子析缸盖子应应盖密，减少溶盖密，减少溶剂挥发剂
14、挥发。实验结果和讨论实验结果和讨论（一）（一）预习预习1.四四环环素的硅藻土薄板素的硅藻土薄板层层析属于哪一种析属于哪一种层层析机制。固定相和流析机制。固定相和流动动相分相分别别是什么？是什么？2.为为了使了使层层析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事析效果好（不拖尾，分离好），操作中注意事项项。（二）（二）实验结实验结果和果和讨论讨论1.在在纸纸上描上描绘绘出薄板上斑点的出薄板上斑点的图图形，量出各斑点形，量出各斑点组组分的距离，分的距离，计计算算Rf值值。2.分析分析实验结实验结果。果。3.总结总结本本实验实验成功或失成功或失败败的的经验经验教教训训。五、思考题五、思考题时间安排时间安排星期一：星期一：制板制板 室温晾干室温晾干 饱和氯化铵缸饱和氯化铵缸星期四：星期四：点样点样 展层展层 显示斑点显示斑点星期四各组自带星期四各组自带小刀小刀和和直尺直尺值日生值日生v 第一第一组组v 第二第二组组v 第三第三组组擦干净实验桌面擦干净实验桌面整理好试剂药品整理好试剂药品扫地、拖地扫地、拖地