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1、GB GB 4789.42010食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验沙门菌沙门菌概况概况n n沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。n n沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国自1911年至90年代初已有255个血清型。n n虽然沙门菌的血清型很多，但多数国家从人体、动物和食品中分离出沙门菌仅约4050个血清型。而在一个国家中的一定时期只约有10个血清型是比较常见的。分类：n n伤
2、寒沙门菌(伤寒、副伤寒)-传染病防治法中规定报告的乙类传染病。n n非伤寒沙门菌-食品卫生标准的检测的主要对象。沙门菌的生物学特性沙门菌的生物学特性形态与染色性：n n革兰氏阴性杆菌，无芽胞,一般无荚膜。n n除鸡瘟沙门菌（S.pullorum)和鸡沙门菌(S.gallinarum)外均有动力。为周身鞭毛，并多数有菌毛。n n大小：13um0.51um。n n营养需求不高，需氧或兼性厌氧。普通营养培养基上均能生长，能够利用柠檬酸盐作为碳源。n n在普通肠道选择性平板上基本上形成无色菌落。菌落中等大小，半透明，表面光滑，边缘整齐或呈锯齿状。n n不分解乳糖，大部分菌株产H2S，发酵葡萄糖产酸不产
3、气。培养与生化特性n n最适培养温度为37，最适pH 7.27.6。n n耐受胆盐，在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至二年之久。沙门菌的分布沙门菌的分布n n沙门菌广泛存在于自然环境中。n n通过沙门菌病患者或健康带菌的人和动物的排泄物污染环境和食品。n n易于污染的高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。n n沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状的改变。沙门氏菌检验程序n n目的：修复损伤的细菌细胞；n n方法：25 g25 g（mLmL）样品）样品225 mL BPW225 mL BPW的无菌均质的无菌均质杯中，以杯中，以8 000 r/mi
4、n8 000 r/min10 000 r/min10 000 r/min均质均质1 min1 min2 min2 min，或置于盛有，或置于盛有225 mL BPW225 mL BPW的无菌均质袋中，的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打用拍击式均质器拍打1 min1 min2 min2 min。若样品为液。若样品为液态，态，不需要均质，振荡混匀。不需要均质，振荡混匀。如使用均质袋，可直接如使用均质袋，可直接进行培养。于进行培养。于36 1 36 1 培养培养8 h8 h18h18h。前增菌无菌均质袋无菌均质袋n n轻轻摇动培养过的样品混合物，移取轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL1 mL,
5、转种转种于于10 mL TTB 10 mL TTB 内内,于于42 1 42 1 培养培养18 18 24 h24 h。同时同时,另取另取1 mL1 mL,转种于转种于10 mL SC10 mL SC内内,于于36 1 36 1 培养培养18 18 24 h24 h。n n分别用接种环取增菌液分别用接种环取增菌液1 1环环,划线接种于一个划线接种于一个BSBS琼琼脂平板和一个脂平板和一个XLDXLD琼脂平板（或琼脂平板（或HEHE琼脂平板或显色琼脂平板或显色培养基平板）。于培养基平板）。于36 1 36 1 分别培养分别培养18 18 24 h 24 h(XLD(XLD琼脂平板、琼脂平板、HE
6、HE琼脂平板、显色培养基平板琼脂平板、显色培养基平板)或或40 h40 h48 h(BS48 h(BS琼脂平板琼脂平板)，观察各个平板上生，观察各个平板上生长的菌落。长的菌落。为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。两种以上选择性分离培养基。选择性增菌与分离进口进口进口进口-SS-SS65.3 65.3 进口进口进口进口-SSSS81.0 81.0 国产国产国产国产-SS-SS52.0 52.0 进口进口进口进口-HE-HE83.2 83.2 国产国产国产国产-HE-HE80.0 80.0 进口进口进口进口-XLD-XLD8
7、3.0 83.0 国产国产国产国产-XLD-XLD86.2 86.2 进口进口进口进口-BS-BS106.6 106.6 国产国产国产国产-BS-BS77.7 77.7 CHROCHRO显色显色显色显色68.4 68.4 国产国产国产国产-DHL-DHL98.4 98.4 国产国产国产国产-WS-WS71.6 71.6 TSATSA（对照）（对照）（对照）（对照）100.0 100.0 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。周围培养基不变
8、。国产BS进口BS国产HE进口HE蓝绿色或蓝色蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。中心黑色或几乎全黑色。进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心菌落为紫红色菌落为紫红色 初筛微生初筛微生物物菌落颜色菌落颜色特异性特异性灵敏度灵敏度沙门氏菌沙门氏菌紫色紫色(直径约直径约1mm)1
9、mm)8989100100%柠檬酸杆柠檬酸杆菌属菌属蓝色蓝色(直径约直径约1mm)1mm)-变形杆菌变形杆菌无色或被抑无色或被抑制制-(铜绿假单胞菌也呈紫红色，铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用荐在检测中的前增菌用TTBTTB。粉红色、深红色、干燥菌落、粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等边缘锯齿状等 均非沙门氏菌均非沙门氏菌菌落。）菌落。）生化试验生化试验 n n自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。n n接种针在接
10、种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 培养18 24 h，必要时可延长至48 h。穿刺穿刺TSI方法方法n n接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h,必要时可延长至48 h。n n将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果沙门氏菌属的三
11、糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果 三糖铁琼脂三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧酶试验培养基赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断初步判断 斜面斜面 底层底层 产气产气 硫化氢硫化氢-+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属-+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属+（）（）（）（）可疑沙门氏菌属可疑沙门氏菌属+/非沙门氏菌非沙门氏菌 注：阳性，阴性；（）多数阳性注：阳性，阴性；（）多数阳性,少数阴性；少数阴性；/阳性或阴性。阳性或阴性。该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时
12、也均有不是沙门菌的可能。除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。TSI的反应的反应 赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应反应序号序号 硫化氢硫化氢（H H2 2S S）靛基靛基质质pH7.2pH7.2尿尿素素氰化钾氰化钾（KCNKCN）赖氨酸脱赖氨酸脱羧酶羧酶A1A1 A2A2 A3A3 /注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/阳性或阴性。阳性或阴性。反应序号反应序号A1A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCNKCN和赖氨酸和赖氨酸脱羧酶脱羧酶3 3项中有项中有1 1项异常项异常,按下表可判定为沙门
13、氏菌。按下表可判定为沙门氏菌。如有如有2 2项异常项异常为非沙门氏菌。为非沙门氏菌。沙门氏菌属生化反应初步鉴别表沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH7.2pH7.2尿素尿素 氰化钾氰化钾(KCN)(KCN)赖氨酸脱羧赖氨酸脱羧酶酶判判 定定 结结 果果 甲型副伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清要求血清学鉴定结果学鉴定结果)沙门氏菌沙门氏菌或或(要求符合本要求符合本群生化特性群生化特性)沙门氏菌沙门氏菌个别变体个别变体(要求血清学要求血清学鉴定结果鉴定结果)注：表示阳性；表示阴性。注：表示阳性；表示阴性。反应序号反应序号2 2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结：补做甘露醇和
14、山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；果均为阳性；反应序号反应序号3 3：补做：补做ONPGONPG，ONPGONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。沙门氏菌属各生化群的鉴别沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定 项项 目目 卫矛醇卫矛醇 山梨醇山梨醇水杨苷水杨苷ONPGONPG丙二酸丙二酸盐盐KCNKCN注：表示阳性注：表示阳性;表示阴性。表示阴性。沙门
15、菌的增菌培养基沙门菌的增菌培养基n n缓冲蛋白胨水(BPW)肉汤：是基础增菌培养基，不含任何抑制成分，有利于受损伤的沙门菌复苏。使受损伤的沙门菌细胞恢复到稳定的生理状态。一般用于加工食品或冷冻食品的前增菌。沙门菌的增菌液沙门菌的增菌液n n四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)：含有胆盐，抑制革兰氏阳性球菌和部分大肠埃希氏菌的生长，而伤寒与付伤寒沙门菌仍能生长。n n亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：可对伤寒及其他沙门菌作选择性增菌，亚硒酸与蛋白胨中的含硫氨基酸结合，形成亚硒酸和硫的复合物，影响细菌硫代谢，从而抑制大肠埃希氏菌、肠球菌和变形杆菌的增殖。沙门菌的分离培养基沙门菌的分离培养基n n亚硫酸铋琼脂
16、（亚硫酸铋琼脂（BSBS）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大）：含有煌绿、亚硫酸铋能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长，但对伤寒、副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门副伤寒等沙门菌的生长无影响。伤寒杆菌及其他沙门菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌能利用葡萄糖将亚硫酸铋还原成硫酸铋，形成黑色菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属菌落周围绕有黑色和棕色的环，对光观察可见有金属光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其光泽。该培养基制备过程不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用时配制，超过选择性，应在临用时配制，
17、超过48h48h不宜使用。不宜使用。注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降注：此培养基在制作过程中过分加热可使培养基的选择性降低，与低，与TTBTTB或或SCSC合用可获得更高的检出率。合用可获得更高的检出率。沙门菌的分离培养基沙门菌的分离培养基n nHE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏阴性的肠道致病菌则无抑制作用。n n沙门菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿色或蓝色，多数菌株产H2S，中心呈黑色或几乎全黑色。沙门菌的分离培养基沙门菌的分离培养基n nXLD琼脂：培养基中含有去氧
18、胆酸钠作指示剂，在该浓度下的去氧胆酸钠也同时作为大肠埃希氏菌的抑制剂，而不影响沙门菌属和志贺菌属的生长。n nXLD培养基分离沙门菌和志贺菌的敏感性超过了传统的培养基，如：EMB、SS、BS。因这些培养基尚有抑制志贺菌属生长的潜在因素，故本培养基是分离鉴定沙门菌及志贺菌属的可靠培养基。在国外广泛使用。分离培养中的注意要点分离培养中的注意要点n n非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型的或可疑的沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。n nHE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经242小时培养后，没有典型的沙门氏菌菌落，则挑
19、取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。n nBS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落，其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养242小时后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养242小时。如果经482小时培养后，仍没有典型或可疑的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。沙门菌显色培养基沙门菌显色培养基n n沙门菌显色培养基主要用于快速筛选、分离沙门菌。其基本原理：利用沙门菌特异性酶与显色基团的特有反应，使色原游离出来，沙门菌在培养基上呈紫色或紫红色。而大肠杆菌等其他肠道杆菌呈蓝绿色。色原-特定结合物色原特定结合物沙门菌辛酸脂酶沙门菌辛酸脂酶无色无色显色游游离离可疑菌落的生化鉴定可
20、疑菌落的生化鉴定n n自选择性琼脂平板（至少自选择性琼脂平板（至少2 2种选择性平板）上直接挑种选择性平板）上直接挑取取2 2个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂个以上可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂(TSI)(TSI)。n nTSITSI的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫的主要成分：蛋白胨、乳糖、蔗糖、葡萄糖、硫酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。酸亚铁铵、硫代硫酸钠、酚红、琼脂。n n在在TSITSI琼脂中有琼脂中有2 2个指示剂体系：个指示剂体系：n n-酚红酚红:在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。在碱性环境中呈红色；在酸性环境中呈黄色。n n-硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫
21、化氢反应生成硫硫酸亚铁铵：是硫化氢的指示剂，可与硫化氢反应生成硫化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成化铁呈黑色。硫代硫酸钠可防止硫化氢氧化形成S-SS-S基而影基而影响反应。响反应。沙门菌在沙门菌在TSI琼脂上的反应琼脂上的反应斜面斜面 底层底层 产气产气 HH2 2S S 可能的菌属和种可能的菌属和种 +/+/+沙门菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、沙门菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌缓慢爱德华氏菌 +/+/+沙门菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌沙门菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌 +伤寒沙门菌、鸡沙门菌、志贺菌属、大肠埃希伤寒沙门菌、鸡沙门菌、志贺菌属
22、、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属斯菌属 +沙门菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、沙门菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌、普罗菲登斯菌属摩根氏菌、普罗菲登斯菌属+/+/非沙门菌非沙门菌赖氨酸脱羧酶试验赖氨酸脱羧酶试验n n赖氨酸脱羧酶试验培养基：蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、溴麝香草酚蓝（紫）。n n原理：细菌使氨基酸脱羧，产生胺类，使培养基变碱，颜色不改变。n n沙门菌的反应：阳性。n n意义：柠檬酸杆菌、志贺菌 均为阴 性；埃希氏菌不定。注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色,而培养
23、基变黄色者为阴性而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。的氧化作用。靛基质试验靛基质试验n n靛基质试验的培养基：蛋白胨水。n n原理：细菌分解蛋白胨中色氨酸，生成靛基质，与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。n n沙门菌的反应：阴性反应或阳性（靛基质阳性变种）。尿素酶试验尿素酶试验n n尿素培养基：蛋白胨、葡萄糖、酚红、氯化钠、磷酸二氢钾、尿素，pH7.2。n n原理：含尿素酶细菌能分解尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，指示剂变红。n n沙门菌的反应：阴性。氰化钾试验
24、氰化钾试验n n氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲对、氯化钠、氰化钾。n n原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门菌与柠檬酸杆菌的鉴定。n n沙门菌生长情况：阴性（不生长）。注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，
25、氰化钾逐试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。细菌生长，呈假阳性反应。沙门菌生化鉴定培养基沙门菌生化鉴定培养基-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(ONPG)试验试验n n-半乳糖苷(ONPG)培养基：蛋白胨、ONPG。n n原理：大肠杆菌含有-半乳糖苷酶，能分解ONPG，使培养基呈黄色。n n沙门菌的反应：阴性。n n注：本试验主要用于不产H2S的沙门菌与大肠杆菌的判定沙门菌生化鉴定的主要试验项目沙门菌生化鉴定的主要试验项目n n糖发酵试验：三糖铁琼脂(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、甘露醇、山梨醇
26、、卫茅醇、水杨苷、ONPG。n n氨基酸和蛋白质代谢试验：靛基质、赖氨酸脱羧酶、尿素酶。n n碳源和氮源利用试验：丙二酸盐。n n其他生化试验：氰化钾。沙门菌在沙门菌在API 20E的典型反应的典型反应第第1 1位数位数第第2 2位数位数第第3 3位数位数第第4 4位数位数第第5 5位数位数第第6 6位数位数第第7 7位数位数结结果果判判定定O ON NP PG GA AD DH HL LD DC CO OD DC CC CI IT TH H2 2S SU UR RE ET TD DA AI IN ND DV VP PG GE EL LG GL LU UMMA AN NI IN NO OS S
27、O OR RR RH HA AS SA AC CMME EL LA AMMY YA AR RA AO OX X124124124124124124124124124124124124124124反反应应结结果果-+-+-+-+-+-+-+-+-沙沙门门菌菌应应得得树树值值024024124124000000004004124124104104020020组组合合编编码码66770044775522VITEKGNI沙门菌的血清学鉴定沙门菌的血清学鉴定n n培养基：一般使用1.5%的琼脂斜面作纯培养，取培养物(抗原)作玻片凝集试验。n n国内使用的沙门菌O抗原多价诊断血清：A-F多价诊断血清。血清
28、学鉴定时的注意要点：n n做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。n nO O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如如2.53%)2.53%)的斜面上，再做凝集。的斜面上，再做凝集。n n如果由于如果由于ViVi抗原的存在而阻止了抗原的存在而阻止了O O抗原的凝集反应抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于时，应挑取菌苔于1mL1mL生理盐水中做成菌悬液。煮生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌常见于伤寒沙门菌)。n n当二相沙门菌只检出一相当二相沙门菌只检出一相H H抗原时，可在琼脂斜面抗原时，可在琼脂斜面上移种上移种1212代后再检查，如仍只检出一相代后再检查，如仍只检出一相H H抗原，抗原，可用位相变异的方法诱导另一相。可用位相变异的方法诱导另一相。