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1、GB 4789.4-2010食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验,沙门菌概况,沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。 沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国发现的有250多个血清型。,沙门菌的分类,根据生化反应不同，分为2个种： 肠道沙门菌（Samonella enterica） ： 肠道亚种（subsp. enterica ） 萨拉姆亚种 （subsp. salamae ） 亚利
2、桑那亚种（subsp. arizonae ） 豪顿亚种（subsp. houtenae ） 因迪卡亚种 （subsp. indica ） 邦戈尔沙门菌（Samonella bongori） ,沙门菌种和亚种的鉴别,沙门氏菌的血清分型,迄今为止沙门氏菌有 57个O抗原 116个H抗原 Vi抗原 被分成2500多个血清型。,Vi抗原,O抗原,H抗原,沙门氏菌命名与书写方式,目前的命名方法规定： 肠道沙门菌肠道亚种（亚种）给予专用名，并采用标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.e
3、nterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为S. Typhimurium。 其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗原式，比如S. 66:z35:- 新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研究所及美国CDC 3个实验室的一致同意。,沙门氏菌检验程序,目的：修复损伤的细菌细胞； 方法：25 g（mL）样品225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态， 不需要均质，振荡混匀
4、。 如使用均质袋，可直接 进行培养。于36 1 培养8 h18h。,前增菌,无菌均质袋,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种于10 mL TTB 内, 于42 1 培养18 24 h。同时, 另取1 mL, 转种于10 mL SC内, 于36 1 培养18 24 h。 分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36 1 分别培养18 24 h (XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。 为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性
5、分离培养基。,选择性增菌与分离,分离培养基回收率测定（%）,典型菌落-BS,菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落, 周围培养基不变。,国产BS,进口BS,典型菌落-HE,国产HE,进口HE,蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色, 中心黑色或几乎全黑色。,典型菌落-XLD,进口XLD,国产XLD,菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心， 或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心,(铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用TTB。 粉红色、深红
6、色、干燥菌落、边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌落。）,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。 接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 培养18 24 h，必要时可延长至48 h。,穿刺TSI方法,接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h, 必要时可延
7、长至48 h。 将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。,沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果,该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。,TSI的反应 赖氨酸脱羧酶试验,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常, 按下表可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性； 反应序号3：补做ONPG，
8、ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。,沙门氏菌属各生化群的鉴别必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定,沙门菌的其他鉴定,API 20E VITEK32 GNI 卡片,沙门菌的血清学鉴定,培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养，取斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验，下部凝结水里的培养物作H抗原。 H抗原的位相诱导试验 制备半固体琼脂，融化完全分装10ml/管，121 灭菌15分钟，冷至50 备用。 取诱导用血清1滴加到小平皿中，倾入冷至50 的10ml半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。 将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过夜。取边缘的菌进行H抗原的检测。,血清学鉴定时的注意要点： 做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。 O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。 有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原，也有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜的培养物进行诱导。,谢谢大家!,