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1、可见紫外分光光度法可见紫外分光光度法第1页，共32页，编辑于2022年，星期六主要主要内容内容第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理第三节 可见分光光度法可见分光光度法第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法第五节 紫外分光光度法简介第2页，共32页，编辑于2022年，星期六目的要求目的要求1.1.掌握分光光度法的基本原理掌握分光光度法的基本原理Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸光系等概念、相互关系及计算。光系等概念
2、、相互关系及计算。光系等概念、相互关系及计算。光系等概念、相互关系及计算。2.2.熟悉标准曲线法及标准对照法。熟悉标准曲线法及标准对照法。熟悉标准曲线法及标准对照法。熟悉标准曲线法及标准对照法。3.3.了解吸收光谱的意义及绘制方法。了解吸收光谱的意义及绘制方法。了解吸收光谱的意义及绘制方法。了解吸收光谱的意义及绘制方法。4.4.了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造,提高测量灵敏度和提高测量灵敏度和准确度的方法。准确度的方法。5.5.了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同了解可见分光光度法和紫外
3、分光光度法的异同了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同点。点。点。点。第3页，共32页，编辑于2022年，星期六分光光度法 根据根据物质的吸收光谱及光的物质的吸收光谱及光的吸收吸收定律定律，对物质进行，对物质进行定性定性、定量定量分分析的一种方法。析的一种方法。第4页，共32页，编辑于2022年，星期六预习问题与提纲预习问题与提纲1在在吸吸收收光光谱谱中中，定定性性分分析析和和定定量量分分析析的的依据依据是什么？是什么？2LambertBeer定律定律的公式及应用？的公式及应用？3可见分光光度法有可见分光光度法有哪两种？哪两种？4分光光度法的分光光度法的误差误差有哪些？有哪些？5如何提高分析
4、的如何提高分析的准确度？准确度？第5页，共32页，编辑于2022年，星期六主要主要内容内容第一节 物质的吸收光谱物质的吸收光谱*第二节 分光光度法基本原理分光光度法基本原理*第三节 可见分光光度法可见分光光度法*第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法*第五节 紫外分光光度法简介*本章小结*参考文献*第6页，共32页，编辑于2022年，星期六第一节物质的吸收光谱 一、物质对光的选择物质对光的选择 性吸收性吸收物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。第7页，共32页，编辑于2022年，星期六第一节物质的吸收光谱二物质的吸收光谱二物质的吸收光谱二物质的吸收光
5、谱二物质的吸收光谱（A-A-图）图）图）图）以波长以波长 为横坐标，吸光为横坐标，吸光度度A A为纵坐标作图，可得为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱一曲线，即为吸收光谱(absorption spectrum)(absorption spectrum)或称或称吸收曲线吸收曲线(absorption curve),(absorption curve),右图为不同浓度时三右图为不同浓度时三(邻邻二氮菲二氮菲)合铁合铁(II)(II)配离子的配离子的吸收光谱。吸收光谱。第8页，共32页，编辑于2022年，星期六第一节物质的吸收光谱特点特点:具有最大吸收波长。不同物质,max不同，max 是定性分
6、析的依据。max几乎不随物质的浓度而变。第9页，共32页，编辑于2022年，星期六第一节物质的吸收光谱maxmax附近，A A最大，并与浓度最大，并与浓度c c 呈正比关系呈正比关系 -定量分析依据。定量分析依据。远离远离max的光的光,物质几乎不吸收光（物质几乎不吸收光（A A00）,这些光这些光的的A A与物质的与物质的c无直接关系无直接关系-不作定量分析依据。不作定量分析依据。注意注意：物质对光的吸收越多，呈颜色：物质对光的吸收越多，呈颜色越深，越深，溶液浓度越浓溶液浓度越浓。第10页，共32页，编辑于2022年，星期六第二节分光光度法基本原理一、一、透光率和吸光度透光率和吸光度入射光入
7、射光I0吸收吸收Ia透射透射ItI0=Ia+It透光率透光率T=It/I0第11页，共32页，编辑于2022年，星期六第二节分光光度法基本原理n nI0溶剂 I0,I0溶液 It T=It/I0透光率的负对数称为吸光度，透光率的负对数称为吸光度，用符号用符号A表示。表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。愈大，溶液对光的吸收愈多。吸光度吸光度A=-lgT=lgI0/It第12页，共32页，编辑于2022年，星期六第二节分光光度法基本原理二二LambertBeer 定律定律当当I0一定时，一定时，A只与液层厚度（只与液层厚度（b）和）和溶液浓度溶液浓度C有关：有关：Io，c一定，一定，AbIo，b一定
8、一定,AcA=abc注意：注意：Beer定律仅适用于单色光。第13页，共32页，编辑于2022年，星期六第一节 物质的吸收光谱单位：单位：b-cm。a为吸光系数：L g-1 cm-1,c单位:g/L。为摩尔吸光系数：Lmol-1cm-1，c单位：mol/L，a与的关系:=aM M表示被测物质的摩尔质量。第14页，共32页，编辑于2022年，星期六第二节分光光度法基本原理由Lambertbeer定律定律可知吸光度与溶液浓度之间为正比关系，液浓度之间为正比关系，而透光率而透光率与溶液浓度之间为指数函数液浓度之间为指数函数关关系：系：-lgT=bc T=10-bc第15页，共32页，编辑于2022年
9、，星期六第二节分光光度法基本原理例：已知某化合物的相对分子质量为例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化，将此化，将此化，将此化合物用乙醇配成浓度为合物用乙醇配成浓度为合物用乙醇配成浓度为合物用乙醇配成浓度为0.150mmol0.150mmol L L-1的溶液，在的溶液，在的溶液，在的溶液，在480nm480nm波长处用波长处用波长处用波长处用2.00cm吸收池测得透光率为吸收池测得透光率为39.8%39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数 及质量吸光系数及质量吸光
10、系数及质量吸光系数及质量吸光系数a a。解：解：解：解：第16页，共32页，编辑于2022年，星期六第二节分光光度法基本原理例：测试酶与腺苷酸(AMP)(AMP)体系的吸光度如下A A(280nm)=0.46(280nm)=0.46，A A(260nm)=0.58(260nm)=0.58，试计算试计算每一组分的浓度。已知：酶的已知：酶的(280nm)=2.96(280nm)=2.96104Lmol-1-1cmcm-1-1(260nm)=1.52 104L104L molmol-1-1 cm-1AMPAMP的的(280nm)=2.4(280nm)=2.4 103L103L molmol-1 cm
11、cm-1-1(260nm)=1.5(260nm)=1.5 104L104L molmol-1-1 cmcm-1-1吸收池厚度为吸收池厚度为1.00cm1.00cm。第17页，共32页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法 一一 分光光度计分光光度计 分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下光源光源 单色单色光器光器 吸收池吸收池 检检测器测器 讯号处理讯号处理 及及显示器显示器第18页，共32页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法二、测定方法二、测定方法可见分光光度法常用于定量测定，根据Lambert-B
12、eer定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，通过下列方法即可求出被测物质含量:第19页，共32页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法1.1.标准曲线法标准曲线法n n在在测测定定溶溶液液吸吸光光度度时时，为为了了消消除除溶溶剂剂或或其其它它物物质质对对入入射射光光的的吸吸收收，以以及及光光在在溶溶液液中中的的散散射射和和吸吸收收池池界界面面对对光光的的反反射射等等与与被被测测物物吸吸收收无无关关的的因因素素的的影影响响，必必须须采采用用空空白白溶溶液液(又又称称参参比比溶溶液液)作作对对照照。常常用用的的空空白白溶溶液液有有下
13、下列列三三种种。溶溶剂剂空空白白 试试剂剂空空白白 试试样样空空白白 第20页，共32页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 可见分光光度法可见分光光度法2.标准对照法n n先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用cs表示)，在max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：cx=cs Ax/As第21页，共32页，编辑于2022年，星期六第四节提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差分光光度法的误差主要来自以下几方面：1.1.溶液偏离溶液偏离BeerBeer定律引起的误差定律引起的误差 测定条件测定条件测定条件测定条件：均匀稳定
14、的稀溶液，单色光。：均匀稳定的稀溶液，单色光。：均匀稳定的稀溶液，单色光。：均匀稳定的稀溶液，单色光。2.2.仪器误差，仪器误差，仪器误差，仪器误差，A A为为0.20.20.7,误差较小。误差较小。3.3.主观误差。主观误差。第22页，共32页，编辑于2022年，星期六第四节提高测量灵敏度和准确度的方法二选择合适的显色剂二选择合适的显色剂条件：条件：1.1.灵敏度灵敏度2.2.选择性高选择性高 3.3.生成的有色物质有确定的组成生成的有色物质有确定的组成4.4.生成的有色物质要稳定生成的有色物质要稳定5.5.显色剂在测定波长处无明显吸收。显色剂在测定波长处无明显吸收。第23页，共32页，编辑
15、于2022年，星期六第四节提高测量灵敏度和准确度的方法三、选择合适的测定条件三、选择合适的测定条件1.波长的选择（波长的选择（入入max）；）；2.显色剂的用量要适量；显色剂的用量要适量；3.酸度（酸度（ApH曲线）；曲线）；4.显色时间（显色时间（At曲线）；曲线）；5.溶液浓度控制在溶液浓度控制在A=0.20.7范围范围;6.掩蔽干扰离子。掩蔽干扰离子。第24页，共32页，编辑于2022年，星期六第五节紫外分光光度法简介 一、一、751-G型分光光度计型分光光度计二、紫外分光光度法的应用二、紫外分光光度法的应用1.定性鉴别n n比较max、(max)或a(max)n n比较吸光度(或吸光系
16、数的比值)2.定量测定3.有机化合物的结构研究第25页，共32页，编辑于2022年，星期六第五节紫外分光光度法简介例已知维生素例已知维生素B1212的的(361nm)=20.7L(361nm)=20.7L g g-1-1 cm-1-1。精密。精密称取样品称取样品30.0mg30.0mg，加水溶解后稀释至1000ml1000ml，在波长361nm361nm处用1.00cm1.00cm吸收池测得样品的吸光度为0.6180.618，计算样品溶液中维生素，计算样品溶液中维生素B B1212的质量分数。的质量分数。解 所测样品溶液中维生素所测样品溶液中维生素B B1212的质量浓度：的质量浓度：第26页
17、，共32页，编辑于2022年，星期六本章小结本章小结n n分光光度法分光光度法分光光度法分光光度法是根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性定性定性定性、定量定量定量定量分析的一种方法。n n以入射光的波长以入射光的波长()为横坐标，溶液的吸光度为横坐标，溶液的吸光度(A A)为为纵坐标画出的曲线，即纵坐标画出的曲线，即吸收光谱吸收光谱吸收光谱吸收光谱，吸收光谱中吸光，吸收光谱中吸光度最大的波长，为最大吸收波长，用度最大的波长，为最大吸收波长，用 maxmax表示。表示。第27页，共32页，编辑于2022年，星期六本章小结本章小结n n分光光度法测定物质含量的依据是Lambert-Be
18、er定律，即A=bc，此处c为物质的量浓度，称为摩尔吸光系数，若用质量浓度代替物质的量浓度c，则相应地改为a，A=ab，a为质量吸光系数，a与及物质的摩尔质量M之间的关系为：=aMn n吸光度A与透光率T的关系是：A=-lgT第28页，共32页，编辑于2022年，星期六本章小结本章小结n n可见分光光度计是以可见光可见光(钨灯钨灯)为光源，而紫外分光光度计是以氢灯氢灯作光源，经单色器分光后提供所需的波长进入被测溶液。n n定量测定时，常用的定量方法有标准曲线法、标准对照法、比吸光系数比较法以及差示分光光度法。它们各有其适用的范围。第29页，共32页，编辑于2022年，星期六本章小结本章小结n
19、n为了提高测量的灵敏度和准确度，必须从以下几个方面考虑：1.提供测定时所需的单色光(一般为max)。2.溶液的浓度宜小。3.在A=0.20.7的范围内测量。4.选择合适的显色剂。5.选择合适的显色条件。第30页，共32页，编辑于2022年，星期六本章小结本章小结n n由于许多物质在可见光区无特征吸收，而在近紫外(200nm400nm)却有特征吸收，故需用紫外光紫外光为光源进行测定。紫紫外分光光度法外分光光度法除了定量测定外，尚能作定性鉴别，纯度检查，并可为结构分析提供信息。第31页，共32页，编辑于2022年，星期六参考文献参考文献1.1.孙毓庆孙毓庆.分析化学分析化学(下册下册)：第四版：第四版.北京：人民卫生出版北京：人民卫生出版社，社，199919992.2.杨根元，金瑞祥，应武林杨根元，金瑞祥，应武林.实用仪器分析：第二版实用仪器分析：第二版.北京：北京：北京大学出版社，北京大学出版社，199719973.3.应武林，顾国耀，杨根元等应武林，顾国耀，杨根元等.分析化学：第四版分析化学：第四版.青岛：青岛：海洋大学出版社，海洋大学出版社，199919994.4.华东理工大学、成都科技大学华东理工大学、成都科技大学.分析化学：第四版分析化学：第四版.北京：北京：高等教育出版社，高等教育出版社，19951995第32页，共32页，编辑于2022年，星期六