《生物化学实验19 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量电子课件 .pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验19 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量电子课件 .pptx（17页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、生物化学实验19 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量电子课件 生物化学实验技术生物化学实验技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性实验类型：综合性 教学时数教学时数教学时数教学时数：6 6生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的1、理解、理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理质分子量的原理2、掌握垂直板电泳的操作技术、掌握垂直板电泳的操作技术生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理 蛋白质蛋白质混合样品中，各蛋白质组分的迁移混合样品中，各蛋白质组分的迁移率主要取决于其分
2、子大小和形状以及所带电荷率主要取决于其分子大小和形状以及所带电荷多少多少。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子表）是一种阴离子表面活性剂。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一面活性剂。在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的定量的SDS，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复复合物。合物。生物化学实验技术 这种复合物由于结合了大量的这种复合物由于结合了大量的SDS，使各，使各种蛋白质都带上相同密度的负电荷，其数量远种蛋白质都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖远
3、超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。生物化学实验技术 此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。的影响几乎可以忽略不计。生物化学实验技术 当当蛋蛋白白质质的的分分子子量量在在15000200000之之间间时时，电电泳泳迁迁移移率率与与分分子子量量的的对对数数值值呈呈直直线线关关系，符合下列方程：系，符合下列方程：log10 Mr=-bmR+KMr蛋白质分子量蛋白质分子量mR相对迁移率相对迁移率
4、b斜率斜率K截距（截距（在条件一定时，在条件一定时，b 和和K均为常数）均为常数）生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、材料：低分子量标准、材料：低分子量标准蛋白质蛋白质2、仪器：垂直板型电泳槽、直流稳压电泳仪、仪器：垂直板型电泳槽、直流稳压电泳仪、移液器、微量注射器、培养皿、滴管等。移液器、微量注射器、培养皿、滴管等。3、试剂、试剂：pH8.9 Tris-HCl缓冲缓冲液，液，pH6.7 Tris-HCl缓冲缓冲液，凝胶液，凝胶贮备贮备液，液，10%SDS溶液，溶液，1%TEMED，10%过过硫酸铵，硫酸铵，pH8.3 Tris-甘甘氨酸缓冲氨酸缓冲液，样品液，样品溶解溶解液，染色
5、液，脱色液。液，染色液，脱色液。生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容1、装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶、装板：将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，模子取出，将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中，形成一个形成一个“夹心夹心”凝胶腔，把装好的凝胶腔置凝胶腔，把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成于仰放的电极上槽。将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台一体的垂直板型电泳装置，垂直放置在水平台面上，灌注胶液（夹子离梳子底边约面上，灌注胶液（夹子离梳子底边约2mm）。）。生物化学实验技术2、配制分离胶：根据所测蛋白质分子量
6、范围，选、配制分离胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不不连续系统，在烧杯中按下表配制所需浓度的分离连续系统，在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶（胶（12%）。）。试剂名称试剂名称用量用量凝胶贮备液凝胶贮备液（30%Acr-0.8%Bis）2.5（mL）分离胶缓冲液分离胶缓冲液（pH8.9Tris-HCl）2.5（mL）10%SDS 0.1（mL）1%TEMED 5（L）重蒸馏水重蒸馏水 3.35（mL）10%AP50（L）总体积总体积10（mL）生物化学实验技术3、分离胶的灌注和聚合：用移液管将所配制、分离胶的灌注和聚合
7、：用移液管将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，留出梳齿的齿高加缓缓注入，留出梳齿的齿高加1cm的空间以便的空间以便灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待分离胶凝固灌注浓缩胶，然后加满蒸馏水。待分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干。生物化学实验技术4、浓缩胶的配制（、浓缩胶的配制（5%）：在烧杯中按下表配）：在烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩制所需浓度的浓缩胶。胶。试剂名称试剂名称用量用量凝胶贮备液凝胶贮备液（30%Acr-0.8%Bis）0.8（mL）浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl）1.25
8、（mL）10%SDS 0.05（mL）1%TEMED 5（L）重蒸馏水重蒸馏水 2.92（mL）10%AP25（L）总体积总体积5.05（mL）生物化学实验技术5、浓缩胶的灌注和聚合：用移液管将所配制、浓缩胶的灌注和聚合：用移液管将所配制的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面的浓缩胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下缓缓注入，将梳子插入胶液顶部，放置室温下待其聚合。待其聚合。6、样品的准备：在低分子量标准蛋白质和待、样品的准备：在低分子量标准蛋白质和待测样品中分别加入适量还原缓冲液，放入沸水测样品中分别加入适量还原缓冲液，放入沸水浴中加热浴中加热35mi
9、n，取出冷至室温。，取出冷至室温。生物化学实验技术7、加样：加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，、加样：加入电极缓冲液，小心拔出梳齿，用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加入用微量注射器向凝胶梳孔内加样。同时加入Marker。8、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始时，电压控制在不高于流电源，刚开始时，电压控制在不高于100V，样品进入分离胶后，电压控制在不高于样品进入分离胶后，电压控制在不高于140V。待指示剂染料靠迁移至下沿待指示剂染料靠迁移至下沿11.5cm处停止电处停止电泳。泳。生物化学实验技术9、染色和脱色：小心将胶取出，放入一大培、染色和
10、脱色：小心将胶取出，放入一大培养皿中。养皿中。染色：加入染色液，置于摇床上染色染色：加入染色液，置于摇床上染色2h。脱色：染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，脱色：染色完毕，倒出染色液，加入脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换一次脱色液，置于摇床上脱色，数小时更换一次脱色液，直至背景清晰，拍照。直至背景清晰，拍照。生物化学实验技术10、相对分子质量的计算：量出分离胶顶端距、相对分子质量的计算：量出分离胶顶端距溴酚蓝间的距离溴酚蓝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中以及各蛋白质样品区带中心与分离胶顶端的距离心与分离胶顶端的距离(cm)，按下式计算相对，按下式计算相对迁移率迁移率mR:生物化学实验技术 以以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上计算出其分子量。率，从标准曲线上计算出其分子量。