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1、专题专题1基因工程的概念基因工程是指基因工程是指按照人们的愿望按照人们的愿望，进行严格的设，进行严格的设计，并通过计，并通过体外体外DNA重组和转基因等技术，赋重组和转基因等技术，赋予生物以予生物以新的遗传特性新的遗传特性，从而创造出更符合人，从而创造出更符合人们需要的们需要的新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品。由于基因。由于基因工程是在工程是在DNA分子水平分子水平上进行设计和施工的上进行设计和施工的。因此又叫做。因此又叫做DNA重组技术重组技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程主要的技术结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因D
2、NA分子水平分子水平人类需要的新生物类型和产品人类需要的新生物类型和产品剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达一、基因工程的原理一、基因工程的原理DNA重组技术或转基因技术重组技术或转基因技术问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。虫害的抗虫棉。想一想：需要做哪些关键工作？需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简
3、要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中在以上过程中关键步骤或难点关键步骤或难点是什么？是什么？普通棉花普通棉花(无无抗虫特性抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因通过运载体导入通过运载体导入通过运载体导入通过运载体导入转基因棉花转基因棉花含含抗虫基因抗虫基因转基因棉花产生转基因棉花产生伴胞晶体伴胞晶体转基因棉花转基因棉花有有抗虫特性抗虫特性二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出
4、来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因抗虫基因与棉花与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因抗虫基因进入棉花细胞进入棉花细胞二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶
5、连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具主要来源：种类与命名：作用特点（特异性）4.限制酶识别序列 5.作用结果：1.1.识别双链识别双链识别双链识别双链DNADNA分子中分子中分子中分子中特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列2.2.切割特定核苷酸序列中的切割特定核苷酸序列中的切割特定核苷酸序列中的切割特定核苷酸序列中的特定位点特定位点特定位点特定位点主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化主要从原核生物中分离纯化产生黏性末端或平末端产生黏性末端
6、或平末端产生黏性末端或平末端产生黏性末端或平末端GoonGoon大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由大多数限制酶的识别序列由6 6 6 6个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成少数的识别序列由少数的识别序列由少数的识别序列由少数的识别序列由4 4 4 4、5 5 5 5或或或或8 8 8 8个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成个核苷酸组成一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶-分子手术刀分子手术刀种类与命名：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。E EcocoR RS Smama粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Se
7、rratiamarcesens）大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichiacolicoliR R）GobackGoback练习：流感嗜血杆菌的练习：流感嗜血杆菌的d d菌株菌株(Haemophilus influenzae d)Haemophilus influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分种限制酶，则分别命名为别命名为:Hind、Hind和和HindEcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端（4）作用结果：作用结果：黏性末端和平末端黏性末端和平末端EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端Sma平末端平末端平末端平末端平末端平末端
8、平末端平末端Q:要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。Q:如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制用同一种限制酶来切割，会怎样呢？酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两者，然后让两者的黏性的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似乎可以合成起来，就似乎可以合成重组的重组的DNA分子了。分子了。思考思考?限制酶的种类限制酶的种类识别序列识别序列切割位点切割位
9、点SmaSmaGGGCCCGGGCCCGCGCBamHBamHGGATCCGGATCCGGGGSau 3ASau 3AGATCGATC GATCGATCHindHindAAGCTTAAGCTTAAAAGATCGGATCCCTAGCCTAGGGGGCCCAAGCTTCCCGGGTTCGAA下表是几种限制酶的识别序列，画出下面四下表是几种限制酶的识别序列，画出下面四 种种DNADNA片段被对应的限制酶切割后的结果。片段被对应的限制酶切割后的结果。剪切结果：剪切结果：GATCGATCCTAGCTAGGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGGGGCCCGGGCCCCCCGGGCCCGGGSma
10、BamHSau3AAAGCTTAAGCTTTTCGAATTCGAAHind大家认真观察这几个大家认真观察这几个DNADNA片段被对应限片段被对应限制酶切割后的末端的结构，你能从中发现什么制酶切割后的末端的结构，你能从中发现什么规律吗？规律吗？规律：规律：1 1、不同限制酶的识别序列和切割位点不同、不同限制酶的识别序列和切割位点不同体现了限制酶的作用特点：特异性体现了限制酶的作用特点：特异性(即：一即：一种限制酶只能切割特定的核苷酸序列种限制酶只能切割特定的核苷酸序列)限制酶在识别序列的中轴线两侧切割则形成限制酶在识别序列的中轴线两侧切割则形成黏性末端，延中轴线切割则形成平末端黏性末端，延中轴线
11、切割则形成平末端如：如：Sau3ASau3A切割切割和和BamHBamH切割切割4、限制酶切割、限制酶切割DNA片段后，可能形成两种结果：片段后，可能形成两种结果：黏性末端和平末端黏性末端和平末端2、同一种限制酶切割形成的末端是相同的、同一种限制酶切割形成的末端是相同的3、不同限制酶切割、不同限制酶切割DNA可能形成相同的黏性末端可能形成相同的黏性末端限制酶所识别的序列，无论是限制酶所识别的序列，无论是6个碱基个碱基还是还是4个碱基，都可以找到一条个碱基，都可以找到一条中心轴线中心轴线（如图），中轴线两侧的双链（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基上的碱基是是反向、对称、重复反向、对称、重复
12、排列的。排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？想一想限制酶所识别的序列有什么特点？实例：实例：1、下列关于限制酶的说法正确的是（、下列关于限制酶的说法正确的是（）A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端后都会形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶磷酸二酯
13、键磷酸二酯键 DNA连接酶连接酶可把切下来的可把切下来的DNA片段拼接成新片段拼接成新的的DNA。即。即:把黏性末端把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“缝合缝合”起来起来实质是实质是实质是实质是把把脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.二二、DNA DNA连接酶连接酶-分子缝合针分子缝合针类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连
14、接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别二二、DNA DNA连接酶连接酶-分子缝合针分子缝合针寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?AGTAC T AATDNA母链母链DNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶寻根问底寻根问底TTAG A TA TCCGACGGTTTAADNADNA连接酶连接酶寻根问底寻根问底思考不同点：不同点：DNADNA连接酶是将连接酶是将_连接起来连接起来,模板
15、模板DNADNA聚合酶是将聚合酶是将_连接起来，连接起来，模板模板都是催化都是催化磷酸二酯键磷酸二酯键的形成的形成两个两个DNADNA片段片段单个核苷酸单个核苷酸共同点：共同点：不需要不需要需要需要Q:外源基因外源基因(如抗虫基因如抗虫基因)怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细胞胞(如棉花细胞如棉花细胞)？1.作用：2.种类：质粒、质粒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物和动植物病毒等。和动植物病毒等。将将外源基因外源基因送入受体细胞。送入受体细胞。三三、基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体-分子运输车分子运输车”最常用的质粒是大肠最常用的质粒是大肠杆菌的质粒杆菌的质粒:常含有常含有抗药基抗
16、药基因因如如:四环素的标记基因。四环素的标记基因。(质质粒的存在与否对受体细胞生存粒的存在与否对受体细胞生存没有决定性作用，但复制没有决定性作用，但复制只能只能在在受体细胞受体细胞内内完成完成)质粒是质粒是一种裸露的、结构简一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟单、独立于细菌染色体（即拟核核DNADNA）之外，并且具有）之外，并且具有自我复自我复制制能力的能力的双双链链环环状状DNADNA分子分子质粒是基因工程最常用的载体质粒是基因工程最常用的载体假如质粒没有限制酶切割位点将怎样？假如质粒没有限制酶切割位点将怎样？（没有限制酶能识别的序列）（没有限制酶能识别的序列）质粒质粒限制酶限制酶？
17、限制酶限制酶？限制酶限制酶？限制酶限制酶？目的基因目的基因1.1.有一个或多个酶切割位点有一个或多个酶切割位点目的基因目的基因插入位点插入位点作为运载体必须具备的条件作为运载体必须具备的条件1.1.有一个或多个酶切割位点有一个或多个酶切割位点重组重组DNA受受体体细细胞胞受受体体细细胞胞假如质粒含有标记基因如：四环素抗性基因假如质粒含有标记基因如：四环素抗性基因含含四环素四环素的培养基的培养基2.2.具有标记基因具有标记基因（四环素抗性基因、氨苄基青霉素（四环素抗性基因、氨苄基青霉素抗性基因等）抗性基因等）作为运载体必须具备的条件作为运载体必须具备的条件1.1.有一个或多个酶切割位点有一个或多
18、个酶切割位点2.2.具有标记基因具有标记基因（四环素抗性基因、氨苄基青霉素（四环素抗性基因、氨苄基青霉素抗性基因等）抗性基因等）受受体体细细胞胞3.3.能自我复制能自我复制作为运载体必须具备的条件作为运载体必须具备的条件1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存2、具有多个限制酶切点，以便与外源基、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接因连接3、具有某些标记基因，便于进行筛选。、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）反应的基因等）4、对受体细胞无害、对受体细胞无害5、分子不能太大，否则不便于
19、操作、分子不能太大，否则不便于操作作为运载体必须具备的条件作为运载体必须具备的条件小结：基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNADNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4DNADNA连接酶连接酶运载运载工具工具具备的具备的条件条件结构简单结构简单,大小适中大小适中能在宿主细胞中自能在宿主细胞中自我复制并稳定存在我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具一个多个限制酶切位点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植
20、物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序 列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只 切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中课堂练习2、DNA连接酶催化的反应是()ADNA复制时母链与子链之间形成氢键 B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接 DA、B、C都不正确3、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便为目的基因的表
21、达提供条件D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选4、质粒是基因工程最常见的载体，它的 主要特点是()能自主复制不能自主复制结构很小 是蛋白质是环状RNA是环状DNA能“友好”地“借居”A、B、C D5、在受体细胞中能检测出目的基因是因为()A、目的基因上有标记 B、质粒具有某些标记基因C、重组质粒能够复制 D以上都不正确6、关于质粒的叙述正确的是()A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子 B、质粒是唯一的载体C、重组质粒是目的基因 D、质粒可在宿主外单独复制7、基因工程中可用作载体的是()质粒 噬菌体病毒 动物细胞核A、B、C D、8、下列关于基因工程中所选用的质粒的说法，错误的是()A、不能没有标记基因 B、是小型链状的DNA分子C、能够自我复制 D可与目的基因重组9、下列黏性末端属于同一限制酶切割而成的是()A、B、C、D、10、要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是()(1)限制酶 (2)连接酶(3)解旋酶 (4)还原酶A、(1)(2)(3)B、(1)(2)(4)C、(1)(2)D、(1)(3)