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1、 1 设计作品名称 槟榔中黄曲霉毒素的检测方案 一、设计背景一、设计背景 本品为棕榈科植物槟榔 Areca catechu L.的干燥成熟种子。春末至秋初采收成熟果实，用水煮后，干燥，除去果皮，取出种子，干燥。在日常生活中槟榔也很常见，槟榔的功能与主治:杀虫，消积，行气，利水，截疟。用于绦虫病，蛔虫病，姜片虫病，虫积腹痛，积滞泻痢，里急后重，水肿脚气，疟疾。中国药典槟榔项下规定要进行黄曲霉毒素的检测。根据查阅中国知网得知黄曲霉毒素是黄曲霉产生的最主要真菌毒素之一,是公认的一类致癌物。黄曲霉毒素具有高毒性、高致癌性、致突变性和免疫抑制性,严重威胁人畜健康。因此,黄曲霉毒素合成、调控及防控的相关工
2、作一直是食品药品安全领域的研究重点和热点。为保证人民用药的安全、应该对中药中黄曲霉毒素的含量进行控制。鉴于药材质量及工业化生产检测的需要，设计一种科学、方便、有效、可行的槟榔中黄曲霉毒素的检验方案很有必要，为槟榔的质量标准和检验方案提供相关参考依据。图 1 槟榔原药材与饮片图 二、设计依据二、设计依据 中国药典2020 版一部规定黄曲菌毒素是槟榔检验项目的必检项目之一。槟榔每 2 1000g 含黄曲霉毒素 B1 不得过 5g，含黄曲霉毒素 G2、黄曲霉毒素 G1、黄曲霉毒素 B2和黄曲霉毒素 B1 总量不得过 10g。槟榔黄曲霉毒素的检测原理:本实验测定的基础是抗原抗体间的特异性反应。黄曲霉毒
3、素单克隆抗体被偶联在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液通过键合有黄曲霉毒素抗体的亲和柱。此时，黄曲霉毒素键合在亲和柱中的抗体上。之后用蒸馏水将免疫亲合柱上的杂质除去。用甲醇洗脱亲和柱，将黄曲霉毒素从抗体上分离下来。由于黄曲霉毒素有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，最后，将过滤的甲醇溶液注入荧光计或 HPLC 进行测定。目前用于测定黄曲霉真菌毒素的方法主要有液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。基于高效液相色谱荧光法设计并完成了一套黄曲霉毒素检测系统。该系统主要由分离系统、恒温控制系统、荧光检测器、主控板和人机交互界面组成。仪器通过分离系统将黄曲霉毒素进行分离,再由荧
4、光检测器激发黄曲霉毒素产生荧光,以光子计数的方式进行信号采集,最终在 PC 的色谱工作站上显示检测结果。本方案主要参考中国药典（一部）（2020 年版）、企业内控标准及高效液相色谱仪操作规程，拟采用高效液相色谱法对槟榔中黄曲霉毒素的检测方法进行设计，为槟榔中黄曲霉毒素的质量控制提供参考依据。三、设计方案三、设计方案 （一）仪器和材料 1.仪器 粉碎机（型号为 DFY1000，鼎历医疗器械有限公司），千分之一电子天平、十万分之一电子分析天平（岛津 JT5003A、AUW120D，岛津科技有限公司）（见下图 2），高速分散器（型号为 EP-05-28，宁波新芝生物科技股份有限公司），高效液相色谱（
5、岛津 LC-10AD 见下图 3），台式高速离心机（型号 TG16-WS，湘仪公司）（见下图 4），超声波清洗仪（型号为 GD410DP10L，深圳市光点超声波设备有限公司）。2.材料 黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2。）均由中国药检所提供。甲醇、乙腈（色谱纯，上海艾锐化工有限公司），水为娃哈哈纯净水，免疫亲合柱（2-8下储存，不可冷冻（北京中科汇仁科技有限公司）（见下图 5）3 图 2 十万分之一电子分析天平 图 3 高效液相色谱仪 图 4 台式高速离心机 图 5 免疫亲和柱（二）溶液的制备 1.供试品溶液的制备 取槟榔原药材，粉
6、碎，药粉过二号筛，取药材粉末约 15g，氯化钠 3g 精密称定，置于均质器中。精密加入 70甲醇溶液 75ml，高速搅拌 2 分钟（以每分钟转速大于 11000转速度），离心 5 分钟（以每分钟 4000 转）精密量取上清液 15ml，置 50ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再次离心 10 分钟（以每分钟 4000 转的速度），精密取上清液 20ml，通过免疫亲合柱（不宜太快，否则吸附不完全，回收率低），流速每分钟 3ml,用水 20ml洗脱（必要时可以先用淋洗缓冲液 10ml 洗脱），弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤 4 出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置 2ml 量瓶中，加甲醇
7、稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22m）滤过，取续滤液，即得。2.对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2、黄曲霉毒素 G1 和黄曲霉毒素 G2。AFB1 以 0.93g/ml 计算；AFB2 以 0.30g/计算；AFG1 以 0.93g/ml计算；以 0.35g/ml 计算。-20避光保存）0.5ml，置 10ml 的量瓶中，用甲醇稀释到刻度，作为存备溶液。检测时精密量取存备溶液 1ml，置 25ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。（现配现用）（三）色谱条件 1.色谱柱：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱规格：长 250mm，内径 4.6mm
8、，填料粒径 5m。2.检测方法：柱后衍生法:碘衍生法 3.流动相：以纯净水-色谱纯甲醇-色谱乙腈（42:40:18）为流动相 4.衍生化泵流速：0.3ml/min。5.衍生化温度：70 6.检测波长：254nm；发射波长:450nm；激发波长:365nm。7.进样室温度：室温（四）方法学考察 1.空白实验 不取样，完全按照供试品溶液下的制备方法来测定，当空白实验干扰峰面积不高于标准曲线浓度最低点峰面积的 1/2 时，可认为无干扰。2.线性范围与标准曲线 吸取对照品溶液（黄曲霉毒素混合溶液）5ul；10ul；15ul；20ul，25ul.分次注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以进样量
9、为横坐标，绘制标准曲线；再吸取槟榔的供试品溶液 20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积。黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2应在指定的浓度范围内。对照品溶液 线性范围 黄曲霉毒素 B1 黄曲霉毒素 B2 黄曲霉毒素 G1 黄曲霉毒素 G2 5 3.精密度试验 仪器精密度：取混标对照品溶液，连续进样五针。计算相对标准偏差（RSD)，应符合规定。4.回收率 计算回收率：要求回收率在 70%110%范围内。(五）高效液相色谱仪操作步骤 1.开机打开控制面板打开输液系统打开紫外检测器打开柱温箱（柱温箱设置70）荧光检测器 2.将配置好的碘衍生溶液、流动相放置相应位置，使柱温箱连接碘衍生溶液，B 泵连接流动
10、相，启动开关。3.设置检测波长：该黄曲霉检测波长为 254nm。设置时间长为 15min。设置完成后，点击应用于所有采集时间点击下载，完成后程序均以准备就绪。4.所配置的流动相跑大约 30min，连接柱温箱的碘衍生溶液使柱温箱的管道均染成棕褐色后即可进样。5.进样：讲槟榔供试品溶液，通过 0.22um 的微孔滤膜将液体滤过至 2ml 进样瓶中。点击电脑“单次运行”弹出操作框，样品名以及样品 ID 改成槟榔，将数据文件名设置成“槟榔黄曲霉毒素样 1-1”，进样体积改成 20ul，点击确认后，窗口弹出第二个操作框：显示：在进样后立即单击“开始”按钮或关闭仪器上的 inject 开关。随之立即从 2
11、ml 进样瓶中精密吸取槟榔供试品溶液 20ul，注入液相色谱仪中，将开关掰至 load，注入液体，再迅速将开关掰至 inject，窗口第二个显示框随之消失，开始出现一条黑色基线。等待15min。平行样设置：等待 15min 之后，按照进样顺序，将数据文件名设置成“槟榔黄曲霉毒素样 1-2”，再吸取槟榔供试品溶液 20ul 注入高效液相色谱仪中。求两者峰面积平均值。6.结果计算：点击桌面左侧“再解析”进入后台实验数据分析，如果槟榔黄曲霉毒素样 1-1 与 1-2 的图谱一致，说明黄曲霉毒素未检出，为合格，否则判定为不合格。四、设计小结四、设计小结 以上试验方案为槟榔中黄曲霉毒素的预实验方案，可根
12、据以上设计的方法进行试验得出实验结果。再依据实验结果进行调整。主要注意以下几点：n=5 B1 B2 G1 G2 RSD(%)6 1.黄曲霉毒素危害极大，应引起重视。2.检测前先多了解被检测物质和成分的性质，了解检测方法的原理及实验中每一步操作的目的，避免不必要的差错。3.实验完成后，所有的最后需要注意的就是每次试验后一定要仔细洗手，黄曲霉素毒性比较大，除了注意常规的生物、化学实验室安全防护（如手套、口罩等是一定要戴的，接触安全区的时候更换手套注意不要交叉污染环境等）之外，可以用次氯酸钠溶液浸泡实验所用的器皿和工具。根据中国药典（一部）（2020 年版）中要求，如果以上方案不能达到预期实验目的，可以通过优化样品前处理方法或色谱条件来达到预期试验效果。五、附加材料五、附加材料 黄曲霉毒素标准色谱图 六六、参考文献、参考文献 1国家药典委员会.中华人民共和国药典（第一部）M.北京：中国医药科技出版社,2020.239.2国家药典委员会.中华人民共和国药典（第四部）M.北京：中国医药科技出版社,2020.61.3陆勤佳，蔡强，沈国金.黄曲霉毒素检测系统的设计与实现.CNKI 知网文化.4邢福国，李旭，张晨曦.黄曲霉毒素的产生机制及污染防控策略.CNKI 知网文化.