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1、实验三培养基的制备及灭菌第1页，共29页，编辑于2022年，星期五一一 、实验目的、实验目的1 1、了解培养基制备原理，学习并掌握培养、了解培养基制备原理，学习并掌握培养 基制备方法。基制备方法。2 2、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。第2页，共29页，编辑于2022年，星期五二、基本原理二、基本原理（一）培养基的制备原理（一）培养基的制备原理v培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。合养料。v从营养角度分析：从营养角度分析：营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐
2、等；和无机盐等；适宜的酸碱度适宜的酸碱度(pH(pH值值)和一定缓冲能力；和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位；一定的氧化还原电位；合适的渗透压。合适的渗透压。第3页，共29页，编辑于2022年，星期五u 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在制成的培养基在9898100100下融化，于下融化，于4545以下凝固，不容易被微生物污染。以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。但多次反复融化，其凝固性降低。第4页，共29页，编辑于2022年，星期五（二）灭菌原理（二）灭菌原理u
3、1 1 干热灭菌原理干热灭菌原理 干热是指相对湿度在干热是指相对湿度在2020以下的高热。干以下的高热。干热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢。一热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢。一般繁殖体在干热般繁殖体在干热8080100100中经中经1 1小时可以杀小时可以杀死，芽孢需死，芽孢需160160170170经经2 2小时方可杀死。小时方可杀死。第5页，共29页，编辑于2022年，星期五u2 2 湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度不断上升，使水的沸点不断提
4、高，从而锅内温度也随之增加。在也随之增加。在0.1MPa0.1MPa的压力下，锅内温度达的压力下，锅内温度达121121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。菌及其高度耐热的芽孢。第6页，共29页，编辑于2022年，星期五第7页，共29页，编辑于2022年，星期五第8页，共29页，编辑于2022年，星期五三、实验器材三、实验器材1、药品、药品 琼琼脂脂，10HCL，10%NaOH，牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养基的配方药品。养基的配方药品。2、材料、材料 具具刻刻度度1000mL塘塘瓷瓷量量杯杯，天天平平，试试管管，量量筒筒，小小烧烧杯杯
5、，玻玻璃璃棒棒，药药匙匙，pH试试纸纸，棉棉花花，报报纸纸，麻绳，标签，培养皿等。麻绳，标签，培养皿等。3、设备、设备 高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。第9页，共29页，编辑于2022年，星期五四、实验方法及步骤四、实验方法及步骤（一）（一）培养基的制备培养基的制备 第10页，共29页，编辑于2022年，星期五u1 1、称称量量u2 2、溶、溶解解u3 3、调pHpHu4 4、过滤u5 5、分装、分装u6 6、加塞、加塞u7 7、包装、包装u8 8、灭菌菌u牛肉膏牛肉膏 3g3gu蛋白蛋白胨 10g10guNaCl 5gNaCl 5gu琼脂脂 20g20
6、gu水水 1000ml1000mlupH 7.07.2 pH 7.07.2 u121121o oC C 灭菌菌20min20min牛肉膏蛋白胨培养基制备步骤：第11页，共29页，编辑于2022年，星期五马铃薯薯(PDA)(PDA)培培养养基培基培养养(霉菌用霉菌用)制制备 马铃薯薯 200g200g 蒸蒸馏水水 1000mL1000mL 蔗糖蔗糖 20.0g20.0g pHpH 自然自然 琼脂脂 20.0g20.0g(1)(1)(1)(1)马铃薯汁制薯汁制备：将将马铃薯去皮，薯去皮，称称量所量所需重量，切成小需重量，切成小块,加水煮沸加水煮沸30min.30min.(2)(2)(2)(2)调节
7、pHpH值第12页，共29页，编辑于2022年，星期五(4)(4)(4)(4)过滤 用用滤纸或或双双层纱布布(中中间夹一一层脱脱脂棉花脂棉花)趁趁趁趁热热过滤过滤。(3)(3)(3)(3)在在滤液中加入液中加入琼脂，煮沸溶解后加糖（用于培脂，煮沸溶解后加糖（用于培养养霉菌霉菌的加入蔗糖，用于培的加入蔗糖，用于培养养酵母菌的加入葡萄糖），酵母菌的加入葡萄糖），补足水足水分，分装。分，分装。(5)(5)分装分装 根据不同的需要，可根据不同的需要，可将将制好的培制好的培养养基分装入基分装入试管或三角管或三角烧瓶内瓶内,包扎管包扎管包扎管包扎管(瓶瓶)口。口。第13页，共29页，编辑于2022年，星期
8、五 斜面的摆法斜面的摆法第14页，共29页，编辑于2022年，星期五注意事项！u（1）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅 拌，避免琼脂糊底烧焦。拌，避免琼脂糊底烧焦。u（2）液体培养基：分装高度以试管的）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。左右为宜。u（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/61/5 灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜u（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3 为宜，灭菌后，垂直待凝成半固
9、体深层琼脂。为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。u（5）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用 干净的纱布擦干净。干净的纱布擦干净。第15页，共29页，编辑于2022年，星期五（二）灭菌（二）灭菌 第16页，共29页，编辑于2022年，星期五第17页，共29页，编辑于2022年，星期五干热灭菌操作步骤：u（1 1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报 纸条包好；用报纸条包好干燥的培养皿。纸条包好；用报纸条包好干燥的培养皿。u（2 2）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不
10、要摆的太挤，以免妨碍气流流通。注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。u（3 3）开启电源，设定温度为）开启电源，设定温度为160160o oC C170170o oC C，保，保 持此温度持此温度1 12 2小时。小时。u（4 4）切断电源，待温度降至）切断电源，待温度降至7070o oC C以下时，打以下时，打 开箱门，取出灭菌物品。开箱门，取出灭菌物品。第18页，共29页，编辑于2022年，星期五第19页，共29页，编辑于2022年，星期五湿热灭菌湿热灭菌 湿湿热灭菌操作步菌操作步骤：1、灭菌物准备、灭菌物准备（1）培养基准备培养基准备（2）无菌水的准备无菌水的准备 用用100ml100ml
11、量筒量取量筒量取90ml90ml的自来水装入的自来水装入250ml250ml的带玻璃珠的三角瓶中，做好棉塞，的带玻璃珠的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮纸包好。用牛皮纸包好。第20页，共29页，编辑于2022年，星期五2 2、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌（1）加水：）加水：将将高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌锅锅的的内内桶桶取取出出，向向外外锅锅内内加加入入适适量量的的水，将内桶放入。水，将内桶放入。（手提式锅）（手提式锅）直直接接加加水水至至锅锅内内底底部部隔隔板板以以下下1/3处处。有有加加水水口口者者由加水口加入至止水线处。由加水口加入至止水线处。（立式锅）（立式锅）（2）装锅：）装锅：把需灭菌的器物放
12、入锅内，关严锅盖。把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖。第21页，共29页，编辑于2022年，星期五（3）接通热源：）接通热源：打打开开排排气气阀阀，待待见见有有大大量量水水汽汽排排出出时时，维维持持3 35min5min，锅锅内内空空气气排排尽尽，关关上上排排气气阀。阀。（手提式锅）（手提式锅）先先将将锅锅盖盖上上排排气气阀阀关关闭闭，同同时时打打开开底底部部排排气气阀阀。待待见见有有大大量量水水汽汽排排出出时时，维维持持3 35min5min，关上底部排气阀。，关上底部排气阀。（立式锅）（立式锅）第22页，共29页，编辑于2022年，星期五（4）升压、升温：）升压、升温：关关闭闭排排气气阀阀以
13、以后后，锅锅内内成成为为密密闭闭系系统统，蒸蒸汽汽不不断断增增多多，压压力力计计和和温温度度计计的的指指针针上上升升，当当压压力力达达到到 1.05 kg/cm2（温温度度为为 121）即即灭灭菌菌开开始始，这这时时维维持持在在1.05 kg/cm2，2030min。除除含含糖糖培培养养基基用用0.56 kg/cm2压压力力外外，一一般般都都用用 1.05 kg/cm2压力。压力。第23页，共29页，编辑于2022年，星期五（5）切断电源：）切断电源：达达到到灭灭菌菌时时间间要要求求后后停停止止加加热热，任任其其自然降压，当指针回到自然降压，当指针回到0时，打开排气阀。时，打开排气阀。第24页
14、，共29页，编辑于2022年，星期五（6）揭揭开开锅锅盖盖，取取出出灭灭菌菌物物，排排掉掉锅锅内内剩剩余水。余水。（7）待待培培养养基基冷冷却却后后置置于于37恒恒温温箱箱内内培培养养24 h，若若无无菌菌生生长长则则放放入入冰冰箱箱或或阴阴凉凉处处保存备用。保存备用。第25页，共29页，编辑于2022年，星期五注意事项！u（1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌）灭菌物不要装得太满，否则灭菌 不彻底。不彻底。u（2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋 紧螺栓，勿使漏气。紧螺栓，勿使漏气。u（3）排气阀不能过早打开，否则培养基因压）排气阀不能过早打开，否则培养基因压 力突
15、降，温度没下降会使培养基翻腾冲到力突降，温度没下降会使培养基翻腾冲到 棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞。棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞。第26页，共29页，编辑于2022年，星期五牛肉膏蛋白胨培养基配制任务：u 100150ml/250ml100150ml/250ml三三角角瓶瓶.（4 4瓶瓶/组）第27页，共29页，编辑于2022年，星期五灭菌任菌任务与与完成步完成步骤：1 1、装有玻璃珠的三、装有玻璃珠的三角角瓶瓶装入装入90ml90ml自自来来水。水。1 1瓶瓶/组2 2、培、培养养基平均分装入三基平均分装入三角角瓶瓶中。中。4 4瓶瓶/组3 3、湿湿热灭菌。菌。4 4、包移液管。、包
16、移液管。2 2支支/人人5 5、包培、包培养养皿。皿。2 2皿皿/人人6 6、干、干热灭菌。菌。第28页，共29页，编辑于2022年，星期五五五 思考题及作业题思考题及作业题u1 1、培、培养养微生物的培微生物的培养养基基应具具备哪哪些些条条件？件？u2 2、为什什么么培培养养基配制好后必基配制好后必须立即立即灭菌？菌？u3 3、在培在培养养基中，基中，琼脂有何作用？脂有何作用？它它有有哪哪些特些特 性？性？u4 4、使用高使用高压蒸汽蒸汽灭菌菌锅灭菌菌时应注意注意哪哪些些 事事项？u5 5、为什什么么干干热灭菌比菌比湿湿热灭菌所需要地菌所需要地温温度度 高，高，时间长？请设计干干热灭菌和菌和湿湿热灭 菌效果比菌效果比较实验方案。方案。第29页，共29页，编辑于2022年，星期五