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1、一、实时荧光定量PCR的原理荧光定量 PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量 PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。第1页/共45页 定量PCR技术的产生l1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度lPCR循环=双链DNA=染料=荧光l后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB第2页/共45页 荧光定量实
2、时PCR与普通PCR的比较l实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期l降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性l增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量l结果分析更加快捷方便，无需跑胶第3页/共45页 罗氏产品介绍以及与同类产品之间的对比第4页/共45页一、LC1.5和LC2.0LightCycler荧光定量PCR系统 LC1.5LC2.0第5页/共45页Lightcycler 1.5 结构分析以空气加热及冷却迅速改变温度带有极高表面积/容量比例的密封20l毛细管加热线圈可容纳32个样品
3、的卡盘将荧光仪定位的分档器发动机将样品置于光学仪上的分档器发动机热室风扇滤器免维护的LED光源光学倍增管第6页/共45页Lightcycler 2.0 结构分析空气加热系统LED激发光源PMT检测系统光纤第7页/共45页热力学结构特点：1、空气加热 2、毛细管反应体系优点:1、升降温速度快（0.05 -20/秒），2、体系均一，不存在边缘现象 3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本 实现快速PCR第8页/共45页光学结构特点：1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上2、光学倍增管（Rodenstock）3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检 测优点：1、毛细管光
4、学特性将光线散射、衍射降至最低，避免LED 功率低的问题2、免维护，带自动检验功能3、轻易实现内标、内对照及多重PCR第9页/共45页LightCycler 结构分析激发光源激发光源 Rodenstock-LED（发光二极（发光二极管）管）冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。检测系统检测系统光学倍增管光学倍增管 (PMT)灵敏度高，宽检验范围灵敏度高，宽检验范围,背景低，无边缘效应背景低，无边缘效应 加热方式加热方式空气加热空气加热管间差小，热传导速率管间差小，热传导速率20/秒，温控变化准秒，温控变化准确（确（0.05-20/秒）。秒）。反应体系反应体
5、系 两种石英玻璃毛两种石英玻璃毛细管体系细管体系(20ul 和和100ul)光学性好，反应体系小，节约试剂成本光学性好，反应体系小，节约试剂成本,适合适合多种用途。多种用途。检测光路范围检测光路范围 530nm,555nm,610nm,640nm,670nm,710nm.六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题第10页/共45页 LightCycler 软件 4.0l 更先进的自动定量方法l全新的相对定量软件l全自动熔点曲线分组l全自动熔点温度提示l简化数据和用户管理第11页/共45页PCR领域最聪明的革新 LightCycler荧光定量PCR系统l超高速
6、30至40分钟完成PCR过程l实时在线监测 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上l高灵敏 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝l范围广 可检测101010拷贝线性范围，无需稀释样品l开放性 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台l六个荧光通道 轻易实现内标、内对照或多重PCRl最小化 定量反应体积降至1020ul，费用低廉l灵活性 支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green Il闭管分析 消除污染风险第12页/共45页Lightcycler 的分析模式适用于所有的通用探针及染料分析模式：l SYBR Green I（荧光染料）lTaqMan（水解探针）lMolecular beaco
7、n（分子信标）lLightcycler上开发独有的分析模式：lHybridization Probe Format（杂交探针）lSimpleProbe（单探针）第13页/共45页 SYBR-Green I 检测模式 SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中，SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在每一循环的延期后进行。SYBR Green I与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过融解曲线分析而得到解决。第14页/共45页 水解探针（Taqman）检测模式 同
8、时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因Taq酶具有的5，3，核酸外切酶活性，可降解荧光探针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量有关。第15页/共45页 分子信标（Molecular Beacon Probe）独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成，探针的5端标记荧光分子，3端 标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5端荧光分子与3端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器就会检测
9、到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。第16页/共45页 杂交探针（HybProbe）检测模式 设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因而不产生信号干扰。第17页/共45页 AnnealingElongationEnd of Elo
10、ngationDenaturationFluoresceinLC Redfor sequence specific detection of DNA杂交探针检测罗氏专利性技术第18页/共45页Template:Plasmid;Target:CycA;Detection Format:Hybridization ProbesStandard CalculatedStandard Calculated concentration concentration9.522E+99.522E+91.024E+91.024E+99.433E+79.433E+71.127E+71.127E+71.029E+6
11、1.029E+69.902E+49.902E+41.021E+41.021E+49.217E+29.217E+29.276E+19.276E+11.085E+11.085E+1H H2 2O O1.0E+101.0E+101.0E+91.0E+91.0E+81.0E+81.0E+71.0E+71.0E+61.0E+61.0E+51.0E+51.0E+41.0E+41.0E+31.0E+31.0E+21.0E+21.0E+11.0E+1H H2 2O O杂交探针的优点：1.灵敏度高2.宽动力学范围3.特异性高4.可用于突变分析Monitoring of PCR with the LightCyc
12、lerUsing Hybridization Probes第19页/共45页 专用于SNP基因分型和突变检测的 SimpleProbe SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多态位点的准确分析结果。第20页/共45页Denaturation phaseDenaturation phase:SimpleProbe free in solution;emission of reporter dye
13、is quenchedSimpleProbe free in solution;emission of reporter dye is quenchedAnnealing phaseAnnealing phase:Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to its complementary targetits complementary target553-p3-pQQR
14、 R3355primerprimer553-p3-pQQR RNew Probe Format:SimpleProbe FormatNew Probe Format:SimpleProbe Format-高效低成本的新型探针高效低成本的新型探针R=Reporter(Fluorescein)Q=Quencher第21页/共45页荧光定量PCR仪的部分应用l医学相关研究 l疾病的临床早期诊断l病原体的含量检测l合理用药分子水平的疗效研究 l疾病的发病监控研究 l肿瘤相关基因肿瘤、耐药基因的检测l研究组织或培养细胞中mRNA的表达水平 各种处理对细胞mRNA含量变化的影响 比较染病组织与正常组织中各
15、种mRNA含量差异lDNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究l基因分型及SNP分析l转基因动物及植物研究第22页/共45页重点问题说明 超高速的热循环 由于采用空气迅速改变温度，以及利用有高表面积/体积比的光学玻璃毛细管模式，使升降温速度最高可达20/秒，温控0.2 ，每2030分钟便能完成3040个循环。升降温数率唯一可调可以根据实验的需要调整升降温速率的系统0.0520 /秒，优化实验。第23页/共45页 配套功能强大的分析软件：（1）绝对定量（具“单点定标”功能）（2）相对定量（可进行效率校正）（3）自动基因分型（SNP）（4）颜色干扰校正 独特的熔点曲线分析功能，可进一步作PCR后分
16、析：-检测非特异扩增并作矫正 -鉴别基因型而又无需采用测序凝胶 -检测点突变，并可利用双色检测及颜色补偿软 件在同 一反应中分析较复杂的突变第24页/共45页 为什么使用DNase-Free&RNase-Free 的光学玻璃 毛细管?l 玻璃反应管可加快热传导速率.l 毛细管增加表面积/体积比，确保空气和反应成分之间的 温度迅速平衡，温度均一.l 缩短了PCR反应时间，特别是荧光激发的时间，保证了 反应成分的稳定性，尤其是荧光染料的稳定性。l 缩小反应体系，降低检测成本。l 光学玻璃毛细管的材料适合荧光讯号的测定，类似光纤 的形状，保证荧光讯号的准确捕获。没有边缘效应.第25页/共45页 Li
17、ghtCycler/毛细管/试剂的成本核算 l仪器的维护费用 LightCycler是免维护的仪器,采用的光源是普通的发光二极管，寿命长达20000小时以上，非常稳定，价格低廉。而卤素灯光源，寿命20000小时。卤素灯。寿命短，需预热，寿命2000小时。LED（发光二极管）,每一个孔位一个独立的激发光源和检测装置。LightCycler光源无需定期更换，稳定方便，光路相同，样本误差最小，节约成本。加热方式 空气加热，温控变化准确（0.4）半导体加热制冷（温控0.5）半导体加热制冷（温控0.5）LightCycler变温速度快，温控精确。升降温速度热传导速率20/秒，（0.05-20/秒)热传导
18、速率2.5/秒 热传导速率2.5/秒 LightCycler升降温速度快，并可调节 运行时间 3040分钟 23小时 1.52.5小时 LightCycler检测时间短，快速出结果，应用最灵活 单点定标功能软件可支持单点定标功能 无 无 LightCycler每次实验节约反应管和反应试剂45份，且单点拟合确保实验结果 反应管反应体系(定量)石英玻璃毛细管10-20ul薄壁塑料管50ul100 ul专用薄壁塑料管50ul100 ul石英玻璃管荧光检测灵敏度好，导热快,试剂用量省 第28页/共45页项项项项 目目目目 ROCHE ROCHE LightCycler 1.5LightCycler 1
19、.5 ABI ABI ABI 7300 ABI 7300 MJ MJ OPTICON I OPTICON I 备备备备 注注注注 光路波长及荧光接收模式530nm,640nm,710nm.并解决相关荧光素荧光干扰问题，光电杂合模式 4通道，无颜色补偿功能,CCD镜头模式(需使用Rox染料进行校正,占用一个通道,实际只有3个通道可用)1通道，无颜色补偿功能,96个LED光源分别检测LightCycler检测波长经过优化，检测范围广泛，通道间相距较远，干扰最小，而且通过颜色补偿功能可将干扰降到最低程度检测方式 实时检测在线观测（每一循环光强度变化，温度变化，反应时间均可观测）实时检测在线观测实时检
20、测在线观测LightCycler可实时检测整个PCR过程，也能在PCR运行中根据试验需要进行实验条件的调节,使用灵活.试剂定量方法Hybridizationprobes(杂交探针):(定量和熔点曲线分析，扩增范围100-1000bp）TaqMan 探针SYBRGREEN I分子航标TaqMan探针（定量，解链曲线分析,扩增范围50-150bpSYBRGREEN I分子航标TaqMan探针（定量，解链曲线分析,扩增范围50-150bpSYBRGREEN I分子航标LightCycler使用的荧光检测模式最多，对于各种临床检测和科研实验，应用最为广泛 动力学范围10X 7X 7X LightCyc
21、ler检测线性范围广泛，无需特别处理样本 第29页/共45页 LC2.0与同质产品的对比项项 目目 ROCHE LightCycler 2.0 ABI ABI 7500 MJ OPTICON 备备 注注 反应管反应体系(定量)石英玻璃毛细管10-100ul薄壁塑料管50ul100 ul专用薄壁塑料管50ul100 ul石英玻璃管荧光检测灵敏度好，导热快,试剂用量省 光路波长及荧光接收模式六通道，530nm,560nm,610nm,640nm,670nm,710nm.并解决相关荧光素荧光干扰问题，光电杂合模式五通道，无颜色补偿功能,CCD镜头模式(使用的探针染料增加)2通道，无颜色补偿功能,96
22、个LED光源分别检测LightCycler检测波长经过优化，检测范围广泛，通道间相距较远，干扰最小，而且通过颜色补偿功能可将干扰降到最低程度第30页/共45页二、LC480LightCycler480实时荧光定量PCR系统 第31页/共45页高灵敏 可检测单拷贝基因动力学范围广 可检测101010个拷贝高重复性 重复性高，CV0.3高分辨率 轻松区分1000拷贝以下2倍浓度差异高速 40分钟完成40个PCR循环技术创新 采用Therma-BaseTM热循环专利技术 和先进的光学检测系 统，彻底消除边缘效应，保持稳定优异的检测结果。灵活 分析模式多样，绝对定量，相对定量，融解曲线分析等几乎 适用
23、所有的检测模式（SYBR Green，Taqman Probe，Hybprobe，SimpleProbe等）模块化 可互换的96孔，384孔加热模块，用户可以自助更换模块，不需要工程师到场自动化平台 配以LIMS系统及自动进样机械臂，可实现远程操作及全 自动化运作用户界面友好 软件直观简洁，易操作LightCycler480系统主要特点第32页/共45页LightCycler480系统主要参数温度控制3795 最大升温速率4.8 最大降温速率2.5 激发光源标准氙灯检测装置冷CCD滤镜激发波长（nm）：450，483，523，558，615 发射波长（nm）：500，533，568，610，6
24、40，670软件功能绝对定量、Tm calling、含效率校正的相对定量、基因分型、产物鉴定等。第33页/共45页 创新的PCR热循环模块设计Therma-BaseTM 是一个内壁布满灯芯状毛细管结构的腔体，通过一系列的冷凝合蒸发，Therma-BaseTM 高效地传递热量，从而实现整板最大的温度均一性。Therma-BaseTM核心优势l 优异的空间温度均一性l 快速、准确的温度调控l 40个循环40分钟(384孔板)第34页/共45页第35页/共45页先进独特的光学系统 LC480系统使用宽光谱、高强度的氙灯作为光源。激发光经过多次反射后形成与孔板大小相同、光强均一的光柱，有效消除边缘效应
25、。激发波长和发射波长的任意组合，使得多种荧光染料和检测模式可用于目前所有的实时荧光定量PCR实验。LC480光学系统的核心优势：最灵活地选择荧光染料及检测模式 整板数据的精确捕获 强大的多重PCR能力第36页/共45页 多检测通道支持所有的检测模式 LightCycler 480系统支持目前所有检测模式的使用，包括杂交探针、SYBR Green I DNA结合染色、单探针、水解探针和分子信标等等。多色荧光检测系统，提供五色激发通道（450 nm,483 nm,523 nm,558 nm,615 nm）和六色荧光检测通道（500 nm,533 nm,568 nm,610 nm,640 nm,67
26、0 nm）,并具有颜色补偿功能；可自由选择，轻松实现多重或多色PCR。第37页/共45页 公认的性能独特的软件 基于用户公认的LC480软件，新的LC480软件采用罗氏独特的算法来进行高度精确、自动化的数据分析。而且，新软件还提供了许多新的的特性，让用户能够轻松、省时地处理高通量的实验数据。LC480软件设计宗旨是为了用户需求量身定做。支持绝对定量、融解曲线分析、相对定量和自动基因分型等功能。LC480软件的核心优势：l采用公认的优秀算法来分析数据l友好的用户界面，简单的快捷方式，便于进行高通量样品编辑及数据处理。l软件模块化，用户可根据自己的研究情况选择性安装。第38页/共45页第39页/共
27、45页模块系统概念 LightCycler 480在系统初始配置的基础上，还可根据客户的特别要求，通过在系统中添加各种先进的软件分析模块进行系统升级，满足用户不同阶段的研究需求。目前可提供的系统模块包括：定性检测 绝对定量分析 相对定量分析 统计分析工具 基因分型研究第40页/共45页良好的兼容性 LightCycler 480可顺利实现与现有实验室系统联结，包括LIMS或是与自动装载微孔板的工作站联用实现全流程的自动化操作。LightCycler 480系统增强流程管理及数据管理的能力：l实现真正的自动化流程l现代化的软件设计思路，可与LIMS连接l兼容性符合数据管理要求（21 CFR-11
28、条款）第41页/共45页 LightCycler 480系统自动化装板过程第42页/共45页 LightCycler480 与ABI 7900 HT 对比LightCycler480ABI 7900 HTPCR专利 Roche拥有临床和科研领域PCR专利 ABI从Roche仅获得科研领域PCR使用授权 光源 氙光源，光源发光波长更广范，强度更强，使得灵敏度达到最大化，通过折叠光路系统，激发光垂直射入每个反应孔位，使各孔位光强均一化，解决边缘效应。氩离子激光光源，顶部激发光，各孔位有光程差，具有边缘效应，需加入校正试剂光路波长 450nm、483nm、523nm、558nm、615nm五色荧光4
29、88nm（单一激发光波长，对很多荧光素不适用）检测系统 CCD成像系统，500nm、533nm、568 nm、610nm、640nm、670nm六个检测通道，具有颜色补偿功能，解决荧光素干扰问题。CCD 成像系统，通过光栅在500660nm连续检测。无颜色补偿功能。（采用普通TaqMan探针技术只能进行双色或三色实验）加热方式 采用therma-base专利技术的半导体加热，解决模块加热的边缘效应，保证每个孔位受热的均一性。半导体加热，热传导最高速率3/秒，加热模块具有边缘效应，中心与周边孔位受热不均一加热模式*96孔/384孔模块式加热。*加热模块更换简便，样本加热模块与相应 热盖成套更换，
30、温控效果更佳，无需进行荧 光素校正。*384孔模块升(降)温最高速率6.3(3.5)/s*96孔模块升(降)温最高速率4.8(2.5)/s*标准模块(96/384)和快速模块(96)。*96/384模块更换时只更换样本模块，使用 同一热盖，更换模块后需要对各种荧光 素进行校正。*标准模式升降温最高速率1.6/s*快速反应模式升降温最高速率3.5/s*9600模式升温0.8/s，降温1.6/s 第43页/共45页运行时间 60min(96 well-plate)，40min(384 well-plate)(3steps，40cycles)标准模式(2steps，40cycles)：120min
31、96孔快速模式(2steps，40cycles)：35min(需减小反应体积、专用的反应管耗材和试剂)反应体系 96孔板/384孔板，封样膜光学透性好。5-20uL(384孔)，20-100uL(96孔)薄壁塑料PCR反应管，20-100ul 标本数量及检测能力384个/PCR，11次/天最多检测4224个标本 96个/PCR，11次/天（快速模式）最多检测1056个标本384个/PCR，3次/天最多检测1152个标本试剂定量方法 Hybridization probes(杂交探针):(定量和熔点曲线分析）、TaqMan 探针、SYBR GREEN I、分子信标、单探针*TaqMan探针*SY
32、BR GREEN I*分子信标加样误差校正 通过640/530等模式（通道间信号消减）进行校正需要加入校正试剂进行校正 试剂供应目前国内几乎所有的厂家以LC为开发平台生产通用试剂，还独有基于杂交探针技术的几十种科研试剂（包括血液学肿瘤学脂代谢基因组学微生物等）。可以使用除杂交探针技术之外的其他通用PCR试剂。快速反应模式需使用专用试剂和耗材分析软件功能*绝对定量*相对定量（含效率校正功能）*Tm值测定（SYBR Green I溶解曲线分析）*基因分型（杂交探针溶解曲线分析等 位基因分析，更适用于SNP分析）*颜色补偿功能*绝对定量*相对定量（默认效率为2）*溶解曲线分析（SYBR Green I）*等位基因分析（终点分析法），结果受孔 位差异影响大第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页