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1、二、实验原理利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，细菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质和DNA发生变性，但是染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。第1页/共16页二、实验原理当pH=4.8的乙酸钾将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构。同时，在反应体系中变性的蛋白质会形成大量沉淀以及十二烷基磺酸钾沉淀，染色体DNA会进一步缠绕在这些沉淀上。离心后，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物等一起沉淀
2、下来而被除去，质粒DNA留在上清里。第2页/共16页二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应
3、增强而提高分辨率。第3页/共16页三、仪器、试剂和材料 1、设备：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、琼脂糖凝胶电泳及分析系统等。2、试剂：Tris、EDTA、SDS、限制性内切酶、含质粒大肠杆菌、琼脂糖、溴化乙锭、DNA marker等。第4页/共16页超净工作台第5页/共16页制冰机第6页/共16页漩涡混匀器第7页/共16页高速冷冻离心机和超速离心机等第8页/共16页水平电泳装置第9页/共16页四、实验操作1、用碱裂解法提取质粒DNA：挑选单菌落小规模扩增后，将2 mL含相应抗生素的 LB加入到容量为15 mL并通气良好的试管中，然后接种入一单菌落，于37剧烈振摇下培
4、养过夜，收集细菌。2、将细菌团块重悬于100L用冰预冷的溶液（150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L TrisHCl，pH80，10 mmol/L EDTA，pH8.0）中剧烈振荡。加200L新配制的溶液(0.2mol/L Na0H,1%SDS)盖紧管口，快速颠倒离心管5次，将离心管放置于冰上。第10页/共16页四、实验操作加150 L用冰预冷的溶液（由5 mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5 mL和水28.5 mL配制而成）。盖紧管口，将离心管倒置后温和地使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将离心管置于冰上3-5min。4，12 000g离心5min，将上清转移到另离心管中
5、。加等量酚：氯仿，振荡混勾，4，12 000g离心2min，将上清转移到另离心管中。加2倍体积的乙醇混匀，室温放置2 min。4，12 000g离心5min，沉淀DNA。用1 mL 70%乙醇于4洗涤DNA沉淀，在空气中让DNA沉淀干燥10min。用50L含无DNA酶的胰RNA酶(20L/mL)的 TE重新溶解DNA，贮存于-20。用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。第11页/共16页四、实验操作3、对提取的质粒DNA进行纯化及酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA，采用胶回收试剂盒纯化质粒DNA；分析质粒DNA的限制性酶切图谱，选择合适的限制性内切酶对质粒DNA进行酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定
6、酶切产物。第12页/共16页五、结果处理 利用凝胶成像系统进行检测第13页/共16页开环(部分解链)闭环(螺旋)闭环(超螺旋)质粒DNA第14页/共16页六、注意事项 1）实验菌种生长的好坏直接影响质粒DNA的提取，因此对存放时间较长的菌种需要事先加以活化。有关细菌培养、保存的方法请查阅微生物有关书籍。2）细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。3）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。4）加入醋酸钾溶液后，可用小玻棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。溶解DNA，加入等体积酚/氯仿抽提，取水相再用乙醇沉淀DNA。第15页/共16页