《（中职）仪器分析项目模块5：高效液相色谱法简介电子课件.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《（中职）仪器分析项目模块5：高效液相色谱法简介电子课件.pptx（54页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、（中职）仪器分析项目模块5：高效液相色谱法简介电子课件项项目模目模块块5：高效液相色：高效液相色谱谱法法简简介介专题项专题项目目1：高效液相色高效液相色谱谱法基本原理法基本原理一、高效液相色一、高效液相色谱谱法概述法概述1、高效液相色、高效液相色谱谱法法简简介介高效液相色高效液相色谱谱（HPLC）是指流）是指流动动相相为为液体的技液体的技术术。早期的液相色。早期的液相色谱谱（经经典液相色典液相色谱谱）是将小体）是将小体积积的的试试液注入色液注入色谱谱柱上部，然柱上部，然后用洗脱液（流后用洗脱液（流动动相）洗脱。相）洗脱。高效液相色高效液相色谱谱法，成法，成为为一种高效、快速一种高效、快速的分离
2、技的分离技术术。高效液相色。高效液相色谱谱法在技法在技术术上，流上，流动动相改相改为为高高压输压输送送;色色谱谱柱是以特殊的方法填柱是以特殊的方法填料填充，从而使柱效大大高于料填充，从而使柱效大大高于经经典液相色典液相色谱谱；同同时时柱后柱后连连有高灵敏度的有高灵敏度的检测检测器，可器，可对对流出流出物物进进行行连续检测连续检测。2、高效液相色、高效液相色谱发谱发展展历历史史二、高效液相色二、高效液相色谱谱法的特点法的特点1、高、高压压；2、高速；、高速；3、高效；、高效；4、高灵敏度；、高灵敏度；5、适、适应应范范围宽围宽。气相色气相色谱谱法与高效液相色法与高效液相色谱谱法的比法的比较较：气
3、相色气相色谱谱法法虽虽具有分离能力好，灵敏度高，具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等分析速度快，操作方便等优优点，但沸点太高点，但沸点太高的物的物质质或或热稳热稳定性差的物定性差的物质质都都难难于于应应用气相用气相色色谱谱法法进进行分析；高效液相色行分析；高效液相色谱谱法，只要求法，只要求试样试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发试样挥发性的限制。性的限制。对对于高沸点、于高沸点、热稳热稳定性定性差、相差、相对对分子量大的有机物原分子量大的有机物原则则上都可上都可应应用用高效液相色高效液相色谱谱法来法来进进行分离、分析。行分离、分析。三、高
4、效液相色三、高效液相色谱谱法的主要法的主要类类型型通常所通常所说说的液相色的液相色谱谱法法仅仅指所用固定相指所用固定相为为柱型的柱液相色柱型的柱液相色谱谱法。通常将液相色法。通常将液相色谱谱法法按分离机理分成吸附色按分离机理分成吸附色谱谱法、分配色法、分配色谱谱法、法、离子色离子色谱谱法和凝胶色法和凝胶色谱谱法四大法四大类类。1、液、液-固吸附色固吸附色谱谱法法流流动动相相为为液体，固定相液体，固定相为剂为剂（如硅胶、（如硅胶、氧化氧化铝铝等）。等）。这这是根据物是根据物质质吸附作用的不同吸附作用的不同来来进进行分离的。液行分离的。液-固吸附色固吸附色谱谱法适用于分离法适用于分离相相对对分子分
5、子质质量中等的油性量中等的油性试样试样，对对具有不同具有不同官能官能团团的化合物和异构体有的化合物和异构体有较较高的高的选择选择性。性。2、液、液-液分配色液分配色谱谱法及化学法及化学键键合相色合相色谱谱流流动动相和固定相都是液体。从理相和固定相都是液体。从理论论上上说说，流流动动相与固定相之相与固定相之间应间应互不相溶，有一个明互不相溶，有一个明显显的分界面。当的分界面。当试样进试样进入色入色谱谱柱，溶柱，溶质质在两在两相相间进间进行分配。行分配。在液在液-液色液色谱谱法中，法中，对对于于亲亲水性固定液常水性固定液常采用疏水性流采用疏水性流动动相，即流相，即流动动相的极性小于固相的极性小于固
6、定液的极性，定液的极性，这这种情况称种情况称为为正相液正相液-液色液色谱谱法。法。反之，流反之，流动动相的极性大于固定液的极性，相的极性大于固定液的极性，则则称称为为反相液反相液-液色液色谱谱法。法。液液-液分配色液分配色谱谱法的缺点：尽管流法的缺点：尽管流动动相与相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动动相中仍有微量溶解；流相中仍有微量溶解；流动动相通相通过过色色谱谱柱柱时时的机械冲的机械冲击击力，会造成固定液流失力，会造成固定液流失导导致保留致保留行行为为的的变变化，柱效和分离化，柱效和分离选择选择性性变变坏等不良坏等不良后果。后果。化学化学键键合
7、固定相，不合固定相，不仅仅用于反相色用于反相色谱谱法、法、正相色正相色谱谱法，法，还还用于离子色用于离子色谱谱法、离子法、离子对对色色谱谱法等色法等色谱谱技技术术上。其中特上。其中特别别是反相化学是反相化学键键合相色合相色谱谱法，由于操作系法，由于操作系统简单统简单，色，色谱谱分离分离过过程程稳稳定，加之分离技定，加之分离技术术灵活多灵活多变变，已，已经经成成为为高效液相色高效液相色谱谱法中法中应应用最广泛的一个分支。用最广泛的一个分支。四、液相色四、液相色谱谱法固定相法固定相、流、流动动液液1、液、液液色液色谱谱法及离子法及离子对对色色谱谱法固定相法固定相这类这类固定相是在担体上涂固定相是在
8、担体上涂渍渍一一层层固定液构成，固定液构成，或使用化学或使用化学键键合相。合相。（1）担体）担体 全多孔型担体；全多孔型担体；表表层层多孔型担体（薄壳型微珠担体）。多孔型担体（薄壳型微珠担体）。这这种担体目前种担体目前应应用用较为较为普遍。普遍。（2）固定液）固定液液液-液色液色谱谱固定相采用机械涂制的方法，固定相采用机械涂制的方法，将固定液涂附在上述担体上，以将固定液涂附在上述担体上，以组组成固定相。成固定相。（3）化学）化学键键合固定相合固定相硅胶表面十八硅胶表面十八烷烷基基键键合相合相硅氧硅碳键型(SiOSiC)，它的化学键稳定，耐水、耐热、耐有机溶剂，是液相色谱应用广泛的固定相。化学键
9、合固定相的分离机制不是全部吸附过程，亦不是典型的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之。2、液固吸附色、液固吸附色谱谱法固定相法固定相采用的吸附采用的吸附剂剂有硅胶、氧化有硅胶、氧化铝铝、分子、分子筛筛、聚聚酰酰胺等，仍可分胺等，仍可分为为全多孔性和薄壳型两种，全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。目前其特点如前所述。目前较较常使用的是常使用的是510m m的硅胶微粒（全多孔型）。的硅胶微粒（全多孔型）。3、液相色、液相色谱谱法流法流动动相相选择选择流流动动相（又称相（又称为为：淋洗液，洗脱：淋洗液，洗脱剂剂）时应时应注意下列几个因素。注意下列几个因素。（1）流）流动动相相纯纯度。一般采用色度。
10、一般采用色谱纯试剂谱纯试剂，必要必要时时需要需要进进一步一步纯纯化，以除去有干化，以除去有干扰扰的的杂杂质质。（2）避免流）避免流动动相与固定相相与固定相发发生作用，使柱生作用，使柱效下降或效下降或损损坏柱子。坏柱子。（3）对试样对试样要有适宜的溶解度，防止要有适宜的溶解度，防止产产生生沉淀并在柱中沉沉淀并在柱中沉积积。（4）溶溶剂剂的粘度小些的粘度小些为为好。好。（5）应应与与检测检测器相匹配。器相匹配。在在选择选择溶溶剂时剂时，溶，溶剂剂的极性是的极性是选择选择的重的重要依据。要依据。除此之外有除此之外有时还时还需要采用二元或多元需要采用二元或多元组组合溶合溶剂剂作作为为流流动动相，以灵活
11、相，以灵活调节调节流流动动相的极相的极性或增加性或增加选择选择性，以改性，以改进进分离或分离或调调整出峰整出峰时时间间。专题项专题项目目2：高效液相色：高效液相色谱仪谱仪典型的高效液相色典型的高效液相色谱仪结谱仪结构和流程可用构和流程可用如下如下图图所示。高效液相色所示。高效液相色谱仪谱仪一般都具一般都具备贮备贮液器、脱气器、高液器、脱气器、高压输压输液液泵泵、梯度洗提装置、梯度洗提装置、进样进样器、色器、色谱谱柱、柱、检测检测器、工作站等主要部器、工作站等主要部件。件。一、一、贮贮液器液器贮贮液器用于存放溶液器用于存放溶剂剂。贮贮液器液器应应配有溶配有溶剂过滤剂过滤器，以防止流器，以防止流动
12、动相中的相中的颗颗粒粒进进入入泵泵内。内。二、脱气装置二、脱气装置为为了消除气泡了消除气泡对对液相色液相色谱谱分析分析结结果的影果的影响，在响，在线线脱气机接于脱气机接于HPLC的流的流动动相相贮贮液器液器与高与高压谱泵压谱泵之之间间。三、高三、高压输压输液液泵泵高高压输压输液液泵泵是液相色是液相色谱仪谱仪的关的关键键部件，部件，其作用是将流其作用是将流动动相以相以稳稳定的流速或定的流速或压压力力输输送送到色到色谱谱系系统统。输输液液泵泵的的稳稳定性直接关系到分定性直接关系到分析析结结果的重复性和准确性。果的重复性和准确性。1、对输对输液液泵泵的基本要求的基本要求（1）流量准确可）流量准确可调
13、调。（2）耐高）耐高压压。（3）液流）液流稳稳定。定。（4）泵泵的死体的死体积积小，小，泵泵的的结结构材料构材料应应耐化耐化学腐学腐蚀蚀。2、高、高压输压输液液泵泵的分的分类类输输液液泵泵按按输输出液恒定的因素分恒出液恒定的因素分恒压泵压泵和和恒流恒流泵泵。其中恒流。其中恒流泵泵的的应应用更广泛。用更广泛。输输液液泵泵按工作方式分按工作方式分为为气气动泵动泵和机械和机械泵泵两大两大类类。（1）活塞型往复活塞型往复泵泵活塞型往复活塞型往复泵泵是液相色是液相色谱仪谱仪中使用最广中使用最广泛的一种恒流泛的一种恒流泵泵。(2)隔膜型往复隔膜型往复泵泵隔膜型往复隔膜型往复泵泵也是一种恒流也是一种恒流泵泵
14、。单活塞往复泵示意图双活塞往复泵示意图隔膜型往复泵示意图四、梯度洗脱装置四、梯度洗脱装置1、进进行梯度洗脱的原因行梯度洗脱的原因类类似于气相色似于气相色谱谱中的程序升温。中的程序升温。为为了使了使保留保留值值相差很大的多种成分在合理的相差很大的多种成分在合理的时间时间内内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技洗脱技术术。3、梯度洗脱装置、梯度洗脱装置线线性梯度：性梯度：在某一段在某一段时间时间内内连续连续而均匀而均匀增加流增加流动动相相强强度。度。阶阶梯梯度：梯梯度：直接从某一低直接从某一低强强度的流度的流动动相相改改变为变为另一另一较较高高强强度的
15、流度的流动动相。相。梯度洗脱梯度洗脱时时，流，流动动相的相的输输送就是要将几送就是要将几种种组组成的溶液混合后送到分离系成的溶液混合后送到分离系统统。高高压压梯度：梯度：一般只用于二元梯度，即用一般只用于二元梯度，即用两个高两个高压泵压泵分分别别按按设设定的比例定的比例输输送送A和和B两种两种溶液至混合器，混合器是在溶液至混合器，混合器是在泵泵之后，即两种之后，即两种溶液是在高溶液是在高压压状状态态下下进进行混合的。行混合的。低低压压梯度：梯度：只需一个高只需一个高压泵压泵，与等度洗，与等度洗脱脱输输液系液系统统相比，就是在相比，就是在泵泵前安装了一个比前安装了一个比例例阀阀，混合就在比例，混
16、合就在比例阀阀中完成。中完成。五、五、进样进样装置装置进样进样器要求密封性好，死体器要求密封性好，死体积积小，重复小，重复性好，性好，进样时进样时引起色引起色谱谱系系统统的的压压力和流量波力和流量波动动要很小。要很小。现现在的液相色在的液相色谱仪谱仪所采用的手所采用的手动动进样进样器几乎都是耐高器几乎都是耐高压压、重复性好和操作方、重复性好和操作方便的六通便的六通阀进样阀进样器。液相色器。液相色谱进样针类谱进样针类似于似于气相色气相色谱进样针谱进样针，只是其，只是其针头为针头为平平头头。操作操作时时先将先将阀阀柄置于采柄置于采样样位置（位置（Load），），用平用平头头微量注射器（体微量注射器
17、（体积应约为积应约为定量管体定量管体积积的的35倍）注入倍）注入样样品溶液，品溶液，样样品停留在定量品停留在定量管中，多余的管中，多余的样样品溶液从流出通道品溶液从流出通道处处溢出。溢出。将将进样进样器器阀阀柄柄顺时针转动顺时针转动60度度进样进样位置位置（Inject）时时，流，流动动相与定量管接通，相与定量管接通，样样品品被流被流动动相相带带到色到色谱谱柱中柱中进进行分离分析。行分离分析。六、色六、色谱谱柱柱色色谱谱柱是柱是实现实现分离的核心部件，要求柱分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能效高、柱容量大和性能稳稳定。定。色色谱谱柱的管外都以箭柱的管外都以箭头显头显著地著地标标示了示了
18、该该柱的使用方向，安装和更柱的使用方向，安装和更换换色色谱谱柱柱时时一定要一定要使流使流动动相能按箭相能按箭头头所指方向流所指方向流动动。色色谱谱柱的正确使用和柱的正确使用和维护维护：（1）避免）避免压压力和温度的急力和温度的急剧变剧变化及任何机化及任何机械震械震动动。（2）应应逐逐渐渐改改变变溶溶剂剂的的组组成，特成，特别别是反相是反相色色谱谱中，不中，不应应直接从有机溶直接从有机溶剂剂改改变为变为全部是全部是水，反之亦然。水，反之亦然。（3）一般）一般说说来色来色谱谱柱不能反冲，反冲会迅柱不能反冲，反冲会迅速降低柱效。速降低柱效。（4）选择选择使用适宜的流使用适宜的流动动相（尤其是相（尤其
19、是pH），以避免固定相被破坏。），以避免固定相被破坏。（5）避免将基）避免将基质质复复杂杂的的样样品直接注入柱内。品直接注入柱内。（6）经经常用常用强强溶溶剂剂冲洗色冲洗色谱谱柱，清除保留柱，清除保留在柱内的在柱内的杂质杂质。（7）保存色）保存色谱谱柱柱时应时应将柱内充将柱内充满满乙乙腈腈或甲或甲醇，柱接醇，柱接头头要要拧紧拧紧，防止溶，防止溶剂挥发剂挥发干燥。干燥。（8）色）色谱谱柱使用柱使用过过程中，如果程中，如果压压力升高，力升高，一种可能是一种可能是烧结滤烧结滤片被堵塞，片被堵塞，这时应这时应更更换滤换滤片或将其取出片或将其取出进进行清洗；另一种可能是大分行清洗；另一种可能是大分子子进
20、进入柱内，使柱入柱内，使柱头头被被污污染；如果柱效降低染；如果柱效降低或色或色谱谱峰峰变变形，形，则则可能柱可能柱头头出出现现塌陷，死体塌陷，死体积积增大。增大。一般在色一般在色谱谱柱前要求安装保柱前要求安装保护护柱，可以柱，可以经经常而且方便地更常而且方便地更换换，起到保，起到保护护延延长长分析柱分析柱寿命的作用。寿命的作用。装在装在HPLC仪仪上柱子如不上柱子如不经经常使用，常使用，应应每隔每隔4-5天开机冲洗天开机冲洗15分分钟钟。七、七、检测检测器器检测检测器是用来器是用来连续监测经连续监测经色色谱谱柱分离后柱分离后的流出物的的流出物的组组成和含量成和含量变变化的装置。化的装置。HPL
21、C检测检测器器应满应满足下列要求足下列要求:具有高具有高灵敏度和可灵敏度和可预测预测的响的响应应；对样对样品所有品所有组组分分都有响都有响应应，或具有可，或具有可预测预测的特异性，适用范的特异性，适用范围围广；广；温度和流温度和流动动相流速的相流速的变变化化对对响响应应没没有影响；有影响；响响应应与流与流动动相的相的组组成无关，可作成无关，可作梯度洗脱；梯度洗脱；死体死体积积小，不造成柱外小，不造成柱外谱带扩谱带扩展；展；使用方便、可靠、耐用，易清洗和使用方便、可靠、耐用，易清洗和检检修；修；响响应值应值随随样样品品组组分量的增加而分量的增加而线线性增性增加，加，线线性范性范围宽围宽；不破坏不
22、破坏样样品品组组分；分；能能对对被被检测检测的峰提供定性和定量信息；的峰提供定性和定量信息；响响应时间应时间足足够够快。快。1、紫外、紫外-可可见见光光检测检测器器紫外紫外-可可见见光光检测检测器的基本器的基本结结构与一般紫构与一般紫外外-可可见见光分光光度光分光光度计计是相同的，包括光源、是相同的，包括光源、分光系分光系统统、试样试样室和室和检测检测系系统统四大部分。四大部分。紫外可紫外可见见吸收吸收检测检测器光路器光路图图2、光、光电电二极管二极管阵阵列列检测检测器器以光以光电电二极管二极管阵阵列作列作为检测为检测元件的紫外元件的紫外可可见见吸收吸收检测检测器。它可构成多通道并行工作，器。
23、它可构成多通道并行工作，得到的是得到的是时间时间、光、光强强度和波度和波长长的三的三维谱图维谱图如如下下图图所示。所示。光光电电二极管二极管阵阵列列检测检测器所得到的三器所得到的三维谱图维谱图优优点：点：灵敏度高；灵敏度高；噪音低；噪音低；线线性性范范围宽围宽；对对流速和温度的波流速和温度的波动动不灵敏，适不灵敏，适用于梯度洗脱及制用于梯度洗脱及制备备色色谱谱；可得任意波可得任意波长长的色的色谱图谱图，极，极为为方便；方便；可得任意可得任意时间时间的光的光谱图谱图，相当于与紫外，相当于与紫外联联用；用；色色谱谱峰峰纯纯度度鉴鉴定、光定、光谱图检谱图检索等功能，可提供索等功能，可提供组组分的定性分的定性信息。信息。缺点：缺点：只能只能检测检测有紫外吸收的物有紫外吸收的物质质；流流动动相的相的选择选择有一定限制，流有一定限制，流动动相的截止相的截止波波长长必必须须小于小于检测检测波波长长。