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1、分析化学吸光光度法分析化学吸光光度法第1页，共48页，编辑于2022年，星期五一一 概述概述 吸光光度法吸光光度法:基于基于物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收而建立的分而建立的分析方法。析方法。分类：分类：根据物质所吸收光的波长范围不同，分根据物质所吸收光的波长范围不同，分为紫外、为紫外、可见可见及红外分光光度法。及红外分光光度法。基本方法：基本方法：有色物质浓度有色物质浓度 颜色深浅颜色深浅 吸收光程度吸收光程度通过比较颜色深浅（吸收光程度），测定物通过比较颜色深浅（吸收光程度），测定物质的浓度。质的浓度。第2页，共48页，编辑于2022年，星期五方法的评价方法的评价适用面广适用面广快
2、速、简便快速、简便分析有色、无色、浅色物分析有色、无色、浅色物溶液状态、均质固态样品溶液状态、均质固态样品灵敏度高：灵敏度高：浓度下限达浓度下限达10-510-6 molL-1准确度高：相对误差通常为准确度高：相对误差通常为25一一 概述概述用于化学平衡等的研究用于化学平衡等的研究适用于分析半微量和微量的物质适用于分析半微量和微量的物质第3页，共48页，编辑于2022年，星期五二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理1.可见光与颜色可见光与颜色阳光阳光棱镜棱镜连续光谱连续光谱物质物质不连续光谱不连续光谱可见光区的划分可见光区的划分:400 450 500 550 600 650 760/
3、nm第4页，共48页，编辑于2022年，星期五互补光的对应关系互补光的对应关系光的互补：蓝光的互补：蓝黄黄二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第5页，共48页，编辑于2022年，星期五光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意2.物质对光的选择性吸收物质对光的选择性吸收 二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系复合光复合光完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光复合光复合光第6页，共48页，编辑于2022年，星期五（3）同一物质）同一物质c不同时吸收曲线不同不同时吸收曲线不同,max 不变
4、不变;（4）max有特征性，可作为定性依据。有特征性，可作为定性依据。（1）同一物质对不同波长光的吸收程度不同）同一物质对不同波长光的吸收程度不同;（2）每种物质都有一个最大吸收波长）每种物质都有一个最大吸收波长(max);信息：信息：物质对光的选择性吸收及吸收曲线物质对光的选择性吸收及吸收曲线A c1c2max二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第7页，共48页，编辑于2022年，星期五三三.光吸收定律光吸收定律Beer-Lambert定律定律Lambert 定律定律:,c,Tc,T一定一定一定一定A 光程距离光程距离(b)A 物质的浓度物质的浓度c-dI I db-dI=k1 I
5、 db吸光度吸光度二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理,b b,T T一定一定一定一定Beer定律定律:第8页，共48页，编辑于2022年，星期五 Beer-Lambert定律定律光吸收定律光吸收定律A吸光度吸光度 Io 入射光强度入射光强度a吸光系数吸光系数 I透射光强度透射光强度 b光程距离光程距离 c浓度浓度 当一束平行单色光通过溶液时，溶液的吸当一束平行单色光通过溶液时，溶液的吸光度光度A与溶液的与溶液的c和和b成正比。成正比。A bc 当当 b 一定时，一定时，A c，可以定量可以定量二二 吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第9页，共48页，编辑于2022年，星期五
6、吸收光吸收光 ，A ，物质浓度物质浓度 。注意注意:（1）物质不吸光，物质不吸光，I=Io ，A=0 物质吸收部分光，物质吸收部分光，IIo，A0（2）A具有加和性，具有加和性，A总总=A1+A2+An（3）入射光的）入射光的：可见光：可见光,紫外光紫外光,红外光红外光（4）光吸收定律的应用条件）光吸收定律的应用条件 稀溶液稀溶液 入射光为单色光入射光为单色光二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第10页，共48页，编辑于2022年，星期五（5）也可以用透射光强度（透射率）也可以用透射光强度（透射率T%）表示）表示T%的含义的含义：物质不吸收光物质不吸收光 I=Io，T%=100%物质
7、吸收部分光，物质吸收部分光，IIo ，T%100%T%，物质的浓度，物质的浓度 。二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第11页，共48页，编辑于2022年，星期五（6）吸光系数的二种表示形式吸光系数的二种表示形式浓度为浓度为1gL-1的溶液，在的溶液，在某波长时，用某波长时，用1cm的比色皿，的比色皿，所测得的吸光度所测得的吸光度浓度为浓度为1molL-1的溶液，在的溶液，在某波长时，用某波长时，用1cm的比色皿，的比色皿，所测得的吸光度所测得的吸光度吸光系数吸光系数a摩尔吸光系数摩尔吸光系数 意义意义单位单位L/gcmL/mol cmA=abcA=abcA=A=bc二二.吸光光度法
8、的基本原理吸光光度法的基本原理第12页，共48页，编辑于2022年，星期五（1）在数值上等于在数值上等于c=1 mol L-1、b=1cm时该溶液时该溶液在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波长和溶在某一波长下的吸光度。是吸收物质在一定波长和溶剂下的特征常数。剂下的特征常数。（2）不随）不随c和和b的改变而改变。在温度和波长等条件一的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，定时，仅与吸收物质本身的性质有关，故仅与吸收物质本身的性质有关，故 可作可作为定性鉴定的参数。为定性鉴定的参数。摩尔吸收系数摩尔吸收系数 的讨论的讨论二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第13页，共48页，编辑于2
9、022年，星期五（3）是物质的吸光能力的度量。同一吸收物质是物质的吸光能力的度量。同一吸收物质在不同波长下的在不同波长下的 值不同。在值不同。在max处的处的 max表明了表明了吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测定可能吸收物质最大限度的吸光能力，反映了测定可能达到的最大灵敏度。达到的最大灵敏度。（4）max越大表明该物质的吸光能力越强，用越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。光度法测定该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏：超高灵敏 =(610)104：高灵敏：高灵敏 =104103：中等灵敏：中等灵敏 103：不灵敏：不灵敏二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原
10、理第14页，共48页，编辑于2022年，星期五例例：已知含已知含Fe2+=500g/L的溶液，当用邻二氮杂菲的溶液，当用邻二氮杂菲为显色剂测定铁时，用为显色剂测定铁时，用2cm比色皿，在波长比色皿，在波长508nm处测处测得吸光度得吸光度A为为0.19。请计算铁的摩尔吸光系数。请计算铁的摩尔吸光系数。解：解：二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第15页，共48页，编辑于2022年，星期五4.偏离偏离Beer-Lambert定律的原因定律的原因 出现的现象：出现的现象：Ac 产生原因：产生原因：1）单色光不纯单色光不纯在高浓度端，在高浓度端，工作曲线呈弯曲状。工作曲线呈弯曲状。A与与c
11、偏离线性偏离线性现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小现有仪器无法获得纯单色光，只能获得小范围的复合光。范围的复合光。二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第16页，共48页，编辑于2022年，星期五按光吸收定律按光吸收定律:IoIo1Io2I1I2I试试样样 若入射光包含若入射光包含1和和2二种波长光二种波长光,当照射试样后当照射试样后二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第17页，共48页，编辑于2022年，星期五讨论讨论:当为纯单色光时，当为纯单色光时，A总总=1bc当单色光不纯时，当单色光不纯时，1=21=2A总总 c线性破坏线性破坏结论：结论：单色光纯度越差，线性越差单
12、色光纯度越差，线性越差1=21=2二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第18页，共48页，编辑于2022年，星期五 2 1 A1 A2例例 1=2 但但 A1 A2 0减少单色光不纯引起偏差方法减少单色光不纯引起偏差方法 在在 max处测量处测量在在在在 max 处处单色光不纯单色光不纯但但 2=0测量误差较小测量误差较小二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第19页，共48页，编辑于2022年，星期五2）溶液本身引起的偏差）溶液本身引起的偏差（1）若溶液浓度大于）若溶液浓度大于0.01molL-1时，粒子时，粒子间的相互作用间的相互作用（2）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在时
13、，）溶液以胶体、乳浊、悬浮状态存在时，有反射、散射作用有反射、散射作用二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第20页，共48页，编辑于2022年，星期五例例:(橙色橙色橙色橙色)(黄色黄色黄色黄色)max=450nmA总总包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体包括离解、缔合、生成新物质、形成异构体使原物质浓度改变使原物质浓度改变吸光度值变化吸光度值变化产生偏离产生偏离pH ，平衡平衡 移移,（3）溶液内部的化学变化）溶液内部的化学变化二二.吸光光度法的基本原理吸光光度法的基本原理第21页，共48页，编辑于2022年，星期五分光光度法分光光度法:仪器仪器分光光度计分光光度计基本组成：基本
14、组成：光源光源单色器单色器样品室样品室显示器显示器检测器检测器三三.仪器和方法仪器和方法第22页，共48页，编辑于2022年，星期五 光源光源(钨灯、氢灯、氘灯）钨灯、氢灯、氘灯）能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱；能发射紫外光区或可见光谱区的连续光谱；足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长足够的辐射强度、稳定性较好、使用寿命较长基本要求基本要求:常用的光源常用的光源:可见光区可见光区:钨灯钨灯(辐射波长为辐射波长为320nm2500nm)紫外区紫外区:氢灯、氘灯氢灯、氘灯(辐射波长为辐射波长为185nm400nm)三三.仪器和方法仪器和方法第23页，共48页，编辑于2022年，星期五 单
15、色器单色器作用作用:将光源发射的复合光分解成单色光的光将光源发射的复合光分解成单色光的光学系统学系统（棱镜或光栅）（棱镜或光栅）三三.仪器和方法仪器和方法组成组成:棱镜棱镜或或光栅光栅等色散元件及狭缝和透镜等等色散元件及狭缝和透镜等第24页，共48页，编辑于2022年，星期五棱镜分光棱镜分光三三.仪器和方法仪器和方法入射狭缝：入射狭缝：光源的光由此进入单色器光源的光由此进入单色器准光装置：准光装置：透镜或反射镜透镜或反射镜使入射光成为平行光束使入射光成为平行光束聚焦装置：聚焦装置：将分光后的单色光聚焦至出口狭缝将分光后的单色光聚焦至出口狭缝 （透镜或凹面镜）透镜或凹面镜）透镜或凹面镜）透镜或凹
16、面镜）色散元件：色散元件：将复合光分解成单色光将复合光分解成单色光第25页，共48页，编辑于2022年，星期五光栅分光原理三三.仪器和方法仪器和方法 利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射角不同而利用不同波长入射光产生干涉条纹的衍射角不同而将复合光分成单色光。将复合光分成单色光。第26页，共48页，编辑于2022年，星期五 样品室样品室用于放置各种类型的吸收池用于放置各种类型的吸收池(比色皿比色皿)和相应和相应的池架附件的池架附件三三.仪器和方法仪器和方法比色皿比色皿厚度厚度:0.5,1,2,3,cm比色皿比色皿:石英池和玻璃池石英池和玻璃池第27页，共48页，编辑于2022年，星期五 检测器检
17、测器作用作用:通过光电效应，使透过吸收池的光信通过光电效应，使透过吸收池的光信号变成可测的电信号的装置。号变成可测的电信号的装置。（光电管或光电倍增管）光电管或光电倍增管）三三.仪器和方法仪器和方法要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。的光强度成正比。(1)光电管光电管(2)光电二极管阵列光电二极管阵列第28页，共48页，编辑于2022年，星期五 (1)光电管光电管三三.仪器和方法仪器和方法涂光敏材料涂光敏材料光照光照光敏材料光敏材料产生电子产生电子产生电流产生电流
18、电压光强度大光强度大电流大电流大第29页，共48页，编辑于2022年，星期五(2)光电二极管阵列光电二极管阵列三三.仪器和方法仪器和方法电容器电容器充电充电电容器电容器放电放电光照射光照射再次充电再次充电测量周期测量周期 电容器充电的电量电容器充电的电量每个二极管检测到的光子数目每个二极管检测到的光子数目成正比成正比光子数与光强度成正比。通过测量整个波长光子数与光强度成正比。通过测量整个波长范围内光强的变化就可得到吸收光谱。范围内光强的变化就可得到吸收光谱。第30页，共48页，编辑于2022年，星期五显示器显示器由检流计、数字显示、微机组由检流计、数字显示、微机组成的自动控制和结果处理系统成的
19、自动控制和结果处理系统三三.仪器和方法仪器和方法第31页，共48页，编辑于2022年，星期五 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择1.显色剂作用显色剂作用 2.显色反应的选择显色反应的选择3.影响显色反应的因素影响显色反应的因素4.显色剂的分类显色剂的分类第32页，共48页，编辑于2022年，星期五1.作用作用无色或浅色无色或浅色试样试样有色物有色物+显色剂显色剂比色比色显色反应显色反应配合反应配合反应氧化还原反应氧化还原反应缩合反应缩合反应重氮化重氮化偶氮化反应偶氮化反应 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择第33页，共48页，编辑于2022年，星期五
20、2.显色反应的选择显色反应的选择(1)灵敏度高灵敏度高 =104105(2)选择性好选择性好(3)有色物组成恒定，化学性质稳定有色物组成恒定，化学性质稳定(4)显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收对比度对比度=max有色物有色物-max显色剂显色剂60nm 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择第34页，共48页，编辑于2022年，星期五3.影响显色反应的因素影响显色反应的因素(1)显色剂用量显色剂用量根据吸光度根据吸光度A与显色剂浓度与显色剂浓度cR的关系来确定的关系来确定cR选择选择引起引起A变化最小处的变化最小处的cR（即曲线平坦处）（即曲线平坦处）
21、M +R MR 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择第35页，共48页，编辑于2022年，星期五例：例：Fe(ssal)+紫红色紫红色pH=1.82.5pH=48Fe(ssal)-2 橙红色橙红色pH=811.5Fe(ssal)3 3-黄色黄色显色时间和温度显色时间和温度由实验得出由实验得出溶剂溶剂一般选择水作溶剂一般选择水作溶剂(2)显色溶液的显色溶液的pH值值 测定不同测定不同pH值下，显色溶液的吸光度值下，显色溶液的吸光度A，以，以A为纵坐标，为纵坐标，pH为横坐标，制图。为横坐标，制图。选择曲线平坦处选择曲线平坦处pH 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色
22、条件的选择第36页，共48页，编辑于2022年，星期五(3)共存离子的干扰共存离子的干扰 可能存在的几种情况：可能存在的几种情况：本身有颜色本身有颜色 与显色剂反应生成有色物与显色剂反应生成有色物消除的方法：消除的方法：*加掩蔽剂加掩蔽剂（掩蔽剂不与被测离子反应，本身及反应产物不影响测定）（掩蔽剂不与被测离子反应，本身及反应产物不影响测定）*选择合适的显色反应条件选择合适的显色反应条件*分离干扰离子分离干扰离子 与显色剂与显色剂 与被测物与被测物生成更稳定的有色物生成更稳定的有色物共共存存离离子子 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择第37页，共48页，编辑于2022年，星
23、期五显色剂的种类显色剂的种类:无机显色剂无机显色剂过氧化氢过氧化氢钼酸铵钼酸铵硫氰酸盐等硫氰酸盐等有机显色剂有机显色剂生色基团：偶氮基、硫羰基、亚硝基等生色基团：偶氮基、硫羰基、亚硝基等助色基团：含胺基、羟基等助色基团：含胺基、羟基等 四、显色反应和显色条件的选择四、显色反应和显色条件的选择第38页，共48页，编辑于2022年，星期五1.入射光波长的选择入射光波长的选择2.参比溶液的选择参比溶液的选择 3.读数范围的选择读数范围的选择五五.测量条件的选择测量条件的选择第39页，共48页，编辑于2022年，星期五1.入射光波长的选择入射光波长的选择:一般选择最大吸收波长一般选择最大吸收波长max
24、若有干扰按实际情况而定若有干扰按实际情况而定波长选择适当，可提高灵敏度和准确性波长选择适当，可提高灵敏度和准确性原则：原则：吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小五五.测量条件的选择测量条件的选择第40页，共48页，编辑于2022年，星期五2.参比溶液的选择参比溶液的选择（在测定波长处）（在测定波长处）（在测定波长处）（在测定波长处）溶剂空白溶剂空白溶剂空白溶剂空白试样空白试样空白试样空白试样空白试剂空白试剂空白试剂空白试剂空白试样试样试样试样+掩蔽剂掩蔽剂掩蔽剂掩蔽剂+显色剂显色剂显色剂显色剂无色无色无色无色无色无色有色有色无色无色无色无色无色无色略有略有略有略有试样试样显色剂显色剂其他试剂其
25、他试剂参比溶液参比溶液有色有色有色有色其他组其他组分分有色有色五五.测量条件的选择测量条件的选择选择的原则选择的原则选择的意义：扣除非待测组分的吸收，可获得选择的意义：扣除非待测组分的吸收，可获得被测定溶液真实的吸光度。被测定溶液真实的吸光度。第41页，共48页，编辑于2022年，星期五3.读数范围的选择读数范围的选择选择的原因选择的原因:因为吸光度（透光度）刻度时的误差因为吸光度（透光度）刻度时的误差（A的标尺是对数标尺，刻度不均匀）。的标尺是对数标尺，刻度不均匀）。（bc）浓度相对误差浓度相对误差透光度读数绝对误差透光度读数绝对误差五五.测量条件的选择测量条件的选择第42页，共48页，编辑
26、于2022年，星期五结论结论：T%=10%70%（A=1.00.15）不同透光度的相对误差（不同透光度的相对误差（T=1T=1）T%T%T%95 20.8 60 3.3 20 3.290 10.7 50 2.9 10 4.380 5.6 40 2.7 5 6.770 4.0 30 2.8 1 22.0透光度透光度T（A）的读数范围为：）的读数范围为：第43页，共48页，编辑于2022年，星期五T=1由读数引起的浓由读数引起的浓度相对误差度相对误差最小最小Tmin=36.8%Amin=0.434T与浓度读数误差的关系曲线与浓度读数误差的关系曲线：36.8%36.8%五五.测量条件的选择测量条件的
27、选择第44页，共48页，编辑于2022年，星期五1.单组分含量测定单组分含量测定3.高含量的组分测定高含量的组分测定示差法示差法六六.具体应用具体应用2.多组分含量测定多组分含量测定第45页，共48页，编辑于2022年，星期五1、单组分含量的测定、单组分含量的测定Ac/molLmolL-1-1A Ax xc cx x步骤步骤:注意注意:标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样品测定标准溶液和样品的配制方法，工作曲线的制作和样品测定时，所使用的仪器、条件必须一致。时，所使用的仪器、条件必须一致。c1A测量测量六六.具体应用具体应用1）选择显色反应）选择显色反应2）选择显色剂）选择显色剂3）优
28、化显色反应条件）优化显色反应条件4）选择检测波长）选择检测波长5）选择合适的浓度）选择合适的浓度6）选择参比溶液）选择参比溶液7）建立标准曲线）建立标准曲线8）样品测定）样品测定吸收曲线吸收曲线标准曲线标准曲线第46页，共48页，编辑于2022年，星期五2、多组分含量的测定多组分含量的测定多组分样品的吸收曲线有三种情况多组分样品的吸收曲线有三种情况I.各组分吸收曲线的各组分吸收曲线的max互不干扰互不干扰在各自的在各自的max处处,按单组分的测定方法进行测定按单组分的测定方法进行测定A1=1 b caA2=2 b cb六六.具体应用具体应用第47页，共48页，编辑于2022年，星期五 II.a组分的组分的1处，处，b组分无干扰，但组分无干扰，但 b组组 分的分的测量测量2处，处，a组分有吸收组分有吸收A1=1bca A2=2bca+2bcbIII.各组分吸收曲线的各组分吸收曲线的max互有干扰互有干扰A1=1bca+1bcbA2=2bca+2bcb六六.具体应用具体应用第48页，共48页，编辑于2022年，星期五