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1、关于植物细胞制药第1页，讲稿共86张，创作于星期二第一节第一节 概述概述第二节第二节 植物细胞的形态和生理特性植物细胞的形态和生理特性第三节第三节 植物细胞培养的基本技术植物细胞培养的基本技术第四节第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素影响植物次级代谢产物累积的因素第五节第五节 植物细胞培养的生物反应器植物细胞培养的生物反应器第六节第六节 进展与展望进展与展望第2页，讲稿共86张，创作于星期二第一节 概述高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原
2、料。人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，人们通过研究，一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前已经研究过的近过的近300种植物细胞培养物可以生产种植物细胞培养物可以生产400多种人们感兴多种人们感兴趣的成分。趣的成分。第3页，讲稿共86张，创作于星期二一、基本概念一、基本概念1.植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养植物组织和细胞培养是指在无菌和人工控制的营养是指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞、（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞
3、、组织和器官以及控制其生长发育的技术。组织和器官以及控制其生长发育的技术。第4页，讲稿共86张，创作于星期二植物无菌培养技术分如下几类：植物无菌培养技术分如下几类：幼苗及较大植株的培养，即为幼苗及较大植株的培养，即为植物培养（植物培养（plant culture）；）；从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组织的培养叫做培养叫做“愈伤组织培养愈伤组织培养”（callus culture）；）；能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团的液体培养，称为液体培养，称为“悬浮培养悬浮培养”（suspension cu
4、lture）；）；第5页，讲稿共86张，创作于星期二离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟果实的培养，称为熟果实的培养，称为“器官培养器官培养”（organ culture）；）；未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则称为“胚胎培胚胎培养养”（embryo culture）。）。第6页，讲稿共86张，创作于星期二2.悬浮培养悬浮培养悬浮培养悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分散性是指在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞
5、聚集体的培养。在此培养条件下组织化水的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件下组织化水平较低。平较低。3.细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱是指利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁殖系。第7页，讲稿共86张，创作于星期二4.分生组织培养分生组织培养分生组织培养（分生组织培养（meristem culture）又称生长锥培养，又称生长锥培养，是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如是指在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。分生组织，如茎尖分生组织的部位仅限于
6、顶端圆锥区，其长度不超过茎尖分生组织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖。研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁殖试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎试验时往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较大的茎尖组织，通常包括尖组织，通常包括12个叶原基。个叶原基。第8页，讲稿共86张，创作于星期二5.外植体外植体外植体（外植体（explant）是指用于植物组织（细胞）培养的是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、
7、花药和花粉等均可作为外植体进行果、穗、胚珠、胚乳、花药和花粉等均可作为外植体进行组织培养。组织培养。第9页，讲稿共86张，创作于星期二6.器官形成器官形成器官形成（器官形成（organogenesis）一般是指在组织培养或一般是指在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。或者在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽；或者在不同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成同部位分别形成芽或根之后，再形成维管组织而将二者连成一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的
8、发生途一个轴，最后形成小植株。如果培养过程中小植株的发生途径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为径与正常的受精卵发育方式极为近似时，通常称为胚胎形成胚胎形成（embryogenesis）。）。当在体细胞或花药培养中培养物是小当在体细胞或花药培养中培养物是小孢子这样的孢子这样的 单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做单倍体细胞，其所形成的胚胎结构叫做“胚状体胚状体”（embryoid，或，或 embryo-like）或或“不定胚不定胚”（adventitious embryo）。）。第10页，讲稿共86张，创作于星期二无性繁殖系（无性繁殖系（clone）又叫克隆，是指使用母体培养物又叫克隆，是
9、指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性繁殖后代而言，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。性系等。在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在在上述无性系的培养中，有时其局部的组织无论在结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如结构、生长速度以及颜色方面都表现出明显的区别，如继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或继续进行选择培养，则从同一无性系可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体无性系的变异
10、体”（clonal variant）。）。7.无性繁殖系无性繁殖系第11页，讲稿共86张，创作于星期二细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞，即为所得的新细胞，即为突变体（突变体（mutant）。）。由单细胞形成的由单细胞形成的无性系称为无性系称为“单细胞无性系单细胞无性系”；如果这种单细胞无性系如果这种单细胞无性系是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做是从同一组织分离得到的，并彼此不同时，叫做“单细单细胞变异体胞变异体”。8.突变体突变体第12页，讲稿共86张，创作于星期二由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一由最
11、初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为代称为“第一代培养第一代培养”。连续多代的培养即为连续多代的培养即为“继代培继代培养养”（subculture），），又称又称“连续培养连续培养”。但习惯上。但习惯上“连连续培养续培养”一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养一词多用于不断加入新的培养基，并连续收集培养物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。物以保持平衡而进行的长期不转移的悬浮培养。9.继代培养继代培养第13页，讲稿共86张，创作于星期二10.次级代谢和次级代谢产物次级代谢和次级代谢产物人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及人们把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及
12、糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下糖类（这些成分通常称为初级代谢产物）以外，具有如下特征的成分称为次级代谢产物：特征的成分称为次级代谢产物：有明显的分类学区域界限；有明显的分类学区域界限；其合成需在一定的条件下才能发生；其合成需在一定的条件下才能发生；缺乏明确的生理功能；缺乏明确的生理功能；是生命的多余成分。是生命的多余成分。第14页，讲稿共86张，创作于星期二现代定义现代定义：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的：次级代谢作用是特殊蛋白质内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了合成、代谢及分解作用的综合体现。上述作用的结果导致了次级代谢产物的产生，如生
13、物碱、黄酮体、萜类、有机酸、次级代谢产物的产生，如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。木质素等。第15页，讲稿共86张，创作于星期二二、植物细胞培养的发展简史二、植物细胞培养的发展简史19世纪上半页，世纪上半页，Schleiden和和Schwann提出了细胞提出了细胞学说；学说；20世纪初，德国著名植物学家世纪初，德国著名植物学家Haber landt依据细胞依据细胞理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，理论，首次提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的观点；直至单个细胞的观点；第16页，讲稿共86张，创作于星期二20世纪世纪20年代初至年代初至30年代，在胚胎培
14、养和器官培年代，在胚胎培养和器官培养领域中取得了一些成果。养领域中取得了一些成果。Hanning首次在无机盐溶液首次在无机盐溶液及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的及有机营养成分的培养基上成功地培养了萝卜和辣根菜的胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌胚，观察到离体胚均能正常发育，同时发现有促进提早萌发成苗的事实。发成苗的事实。自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、自此植物器官与营养需求之间关系研究、原生质体、培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技培养基以及培养方法的研究获得了高度重视，基因工程技术也被用于植物次级代谢产物的生产中。术也被用于植物次
15、级代谢产物的生产中。第17页，讲稿共86张，创作于星期二30年代末至年代末至40年代，研究工作主要集中在植物细年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系上。胞器官与营养需求之间的关系上。Overbeek（1941）在曼陀罗幼胚的培养基中，以椰子乳作为附加物，发现在曼陀罗幼胚的培养基中，以椰子乳作为附加物，发现幼胚可以成熟。在茎尖培养方面的最早研究工作，是从幼胚可以成熟。在茎尖培养方面的最早研究工作，是从我国学者罗士韦（我国学者罗士韦（1946）利用寄生植物菟丝子茎尖培养，）利用寄生植物菟丝子茎尖培养，观察到花的形成开始的。此研究对于后人用组织培养方观察到花的形成开始的。此研究对于
16、后人用组织培养方法诱导花芽形成起到了积极作用。法诱导花芽形成起到了积极作用。第18页，讲稿共86张，创作于星期二40年代末至年代末至50年代，植物组织培养进入了一个崭新阶段。年代，植物组织培养进入了一个崭新阶段。Skoog和我国学者崔澄在研究烟草茎段和髓培养及其器官形和我国学者崔澄在研究烟草茎段和髓培养及其器官形成的工作中，发现腺嘌呤或腺苷能够解除培养基中生长素成的工作中，发现腺嘌呤或腺苷能够解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，并诱导芽的形成，确定）对芽形成的抑制作用，并诱导芽的形成，确定了腺嘌呤了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之生长素的比例是控制芽和根形成的主要条
17、件之一。研究结果显示：该比例高时，产生芽；比例低时，则一。研究结果显示：该比例高时，产生芽；比例低时，则形成根。形成根。Miller等（等（1956）发现了激动素（）发现了激动素（kinetin，KT），），后来又发现激动素亦可促进芽的形成，其效力约为腺嘌呤后来又发现激动素亦可促进芽的形成，其效力约为腺嘌呤的的30000倍。倍。1956年，年，Routie和和Nickell在一个专利中首次在一个专利中首次提出利用细胞培养技术来生产有用的次级代谢产物。提出利用细胞培养技术来生产有用的次级代谢产物。第19页，讲稿共86张，创作于星期二60年代初，年代初，Cocking等人首次利用真菌的纤维素酶成等
18、人首次利用真菌的纤维素酶成功地分离出植物的原生质体。功地分离出植物的原生质体。Muraskign和和Skoog于于1962年年开发了化学成分完备的生长培养基（开发了化学成分完备的生长培养基（Muraskign and Skoog Medium，MS培养基），为植物细胞培养及其次级代谢产培养基），为植物细胞培养及其次级代谢产物的生产奠定了坚实的基础。物的生产奠定了坚实的基础。60至至70年代中叶的主要工作是开发培养基和研究培养方年代中叶的主要工作是开发培养基和研究培养方法，对植物细胞生理、生化代谢及生物反应器对植物细胞生法，对植物细胞生理、生化代谢及生物反应器对植物细胞生理状态的影响知之较少，而
19、次级代谢产物产率低则是制约商理状态的影响知之较少，而次级代谢产物产率低则是制约商业化开发的主要障碍。业化开发的主要障碍。第20页，讲稿共86张，创作于星期二1975至至1985年期间，科学家们主要进行了优化细胞年期间，科学家们主要进行了优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬紫生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬紫草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商业产品。草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商业产品。植物细胞工程在经历了植物细胞工程在经历了80年代后期的低潮以后，年代后期的低潮以后，90年代年代初又焕发了新的活力。科学家们进行了深入的研究和开发工初又焕发了新的活
20、力。科学家们进行了深入的研究和开发工作，特别是应用了分子生物学技术。利用红豆杉（作，特别是应用了分子生物学技术。利用红豆杉（Taxus chinensis）细胞培养生产抗癌新药紫杉醇（）细胞培养生产抗癌新药紫杉醇（taxol），），是近年来推动本领域快速发展的热点与动力，是近年来推动本领域快速发展的热点与动力，Phyton公司已在公司已在75000L反应器中利用红豆杉细胞培养生产紫杉反应器中利用红豆杉细胞培养生产紫杉醇，显示了光明的前景。醇，显示了光明的前景。第21页，讲稿共86张，创作于星期二第二节 植物细胞的形态和生理特征一、植物细胞的形态一、植物细胞的形态植物细胞的形态多种多样，随植物种
21、类、存在部位植物细胞的形态多种多样，随植物种类、存在部位和功能的不同而异。和功能的不同而异。游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭游离的或排列疏松的薄壁细胞多呈球形、类圆形和椭圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，圆形；排列紧密的细胞多呈角形；具有支持作用的细胞，细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细细胞壁常增厚，呈类圆形、纺锤形等；具有输导作用的细胞则多呈管状。胞则多呈管状。第22页，讲稿共86张，创作于星期二植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，植物细胞大小不一。植物基本组织细胞体积较大，种子植物薄壁细胞的直径在种子植物薄壁细胞的直径在20100微米之
22、间；储藏组微米之间；储藏组织细胞的直径可达织细胞的直径可达1mm。苎麻纤维一般为。苎麻纤维一般为200mm，有的，有的可达可达500mm以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至以上。最长的细胞是无节乳管，长达数米至数十米不等。数十米不等。第23页，讲稿共86张，创作于星期二二、植物细胞的结构特征二、植物细胞的结构特征根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞根据典型细胞核的有无可将生物细胞分为原核细胞（prokaryotic cell）和真核细胞（）和真核细胞（eukaryotic cell）。真）。真核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核，原核细胞中核细胞有典型的、为双层膜所包被着的细胞核
23、，原核细胞中只有类核（只有类核（nucleoid）。类核没有核膜包被，常常只有一）。类核没有核膜包被，常常只有一条条DNA，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。，其周围即为细胞质。高等植物的细胞均为真核细胞。与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有与动物细胞及微生物细胞相比，植物细胞有3个特点，即具有个特点，即具有细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）。细胞壁、液泡和质体（如叶绿体）。第24页，讲稿共86张，创作于星期二三、细胞后含物和生理活性物质三、细胞后含物和生理活性物质细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物细胞中除含有生命的原生质体外，还有许多非生命的物质，它们均为细胞代谢过程
24、中的产物。一类是后含物，系储藏质，它们均为细胞代谢过程中的产物。一类是后含物，系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类（saccharide）、）、盐类（盐类（salts）、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；另一类为）、生物碱、苷、有机酸、挥发油等；另一类为生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用，含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激含量虽少，但其生理作用却非常重要，如酶、维生素、植物激素和抗生素等。素和抗生素等。第25页，讲稿共86张，创作于星期二1.细胞后含物细胞后含物（
25、1）生物碱）生物碱生物碱（生物碱（alkaloide）是一类含氮的有机化合物，广布）是一类含氮的有机化合物，广布于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、于植物界。含生物碱较多的植物科有：茄科、罂粟科、小檗科、豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相豆科、夹竹桃科等。按照植物化学分类学的观点，亲缘关系相近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含近的植物，常含有化学结构相似的成分。此外，一种植物所含的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十的同一类成分中也经常存在多种化学成分，如人参中含有几十种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多
26、种种人参皂苷。它们均属于三萜皂苷类成分。中草药中含有多种生物碱，如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理生物碱，如麻黄碱、咖啡、阿托品、喹啉、黄连素等，其生理活性都很强。活性都很强。第26页，讲稿共86张，创作于星期二（2）糖苷类）糖苷类糖苷（糖苷（glucosides）是指某些有机化合物和糖经苷）是指某些有机化合物和糖经苷键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而键结合而成的化合物，例如黄酮苷是黄酮苷元和糖连接而成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋成。很多糖苷类化合物对疾病都有很好的治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；地黄毒苷有强心作
27、用；大黄中的蒽醌苷有强烈的泻下作用；紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然紫草中紫草宁是紫草中蒽醌类化合物的总称，除作为天然色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。色素（如口红）外，尚具有很好的抗癌活性。第27页，讲稿共86张，创作于星期二（3）挥发油）挥发油挥发油（挥发油（volatile oil）是一类具有芳香气味，在常温下）是一类具有芳香气味，在常温下易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多有分布易于挥发的油类。在伞形科、姜科、唇形科等植物中多有分布。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油等。很多挥发油可作药用，如薄荷油、丁香油、桉油等。（4）有机酸）有机酸有机酸
28、（有机酸（organic acids）是糖类代谢的中间产物。植）是糖类代谢的中间产物。植物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸物果实中酸味以及细胞液的酸性反应，主要是由于有机酸的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、的存在。常见的植物有机酸有：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。酒石酸等。第28页，讲稿共86张，创作于星期二2.生理活性物质生理活性物质（1）酶类）酶类生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动生理活性物质是一类对细胞内的生化反应和生理活动起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗起调节作用的物质的总称。包括酶、维生素、植物激素和抗生素等。生素
29、等。酶（酶（enzymes）是一种有机催化剂。酶反应一般在常）是一种有机催化剂。酶反应一般在常温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重温、常压、中性水溶液中进行，高温、强酸、强碱和某些重金属离子，会使其失活。金属离子，会使其失活。第29页，讲稿共86张，创作于星期二（2）维生素）维生素维生素（维生素（vitamin）是一类复杂的有机物，常参与酶的）是一类复杂的有机物，常参与酶的形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难形成，对植物的生长、呼吸和物质代谢有调节作用，如对难以生根的植物，用维生素以生根的植物，用维生素B12处理后可促进不定根的生长。处理后可促进不定根的生长。（
30、3）植物激素）植物激素植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节植物激素是植物细胞原生质体产生的一类复杂的调节代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作代谢的有机物质，对生理过程（如细胞分裂和繁殖）产生作用，其量虽微，但作用甚大。用，其量虽微，但作用甚大。第30页，讲稿共86张，创作于星期二（4）抗生素和植物杀菌素）抗生素和植物杀菌素抗生素（抗生素（antibiotic）是由微生物（如某些菌类植物）是由微生物（如某些菌类植物）产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链产生的能杀死或抑制某些微生物生长的物质，如青霉素、链霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的
31、霉素等。高等植物如葱、蒜、辣椒、萝卜等也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素（物质，称为植物杀菌素（plant fungicidin）。）。第31页，讲稿共86张，创作于星期二四、植物培养细胞的生理特性四、植物培养细胞的生理特性植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。植物培养细胞不同生长阶段的持续时间及特征。延迟期（延迟期（lag phase）细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取细胞分裂的初始期和最大生长期之间，其持续时间取决于培养前的条件、时期和培养基性质，其特征是细胞数决于培养前的条件、时期和培养基性质，其特征是细胞数量、干重近乎恒定，细胞壁厚度达最大；高量、干重近乎恒定，细胞壁厚
32、度达最大；高RNA含量；高含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分。增加细胞的细胞质部分。第32页，讲稿共86张，创作于星期二加速期（加速期（acceleration phase）细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳细胞最大生长期和最大细胞浓度，最佳DNA浓度和浓度和蛋白质累积率，持续时间蛋白质累积率，持续时间34代，其特征为常数：干重；增代，其特征为常数：干重；增加：细胞数、加：细胞数、DNA和蛋白质浓度；减少：有丝分裂活性、和蛋白质浓度；减少：有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力；增加细胞鲜种、干重及含量和蛋
33、白质合成能力；增加细胞鲜种、干重及RNA酶活性。酶活性。第33页，讲稿共86张，创作于星期二对数期（对数期（log phase）介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间介于最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间，其特征，其特征为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核糖为蛋白质合成能力减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核糖体和寡核糖体形成的方向减少。体和寡核糖体形成的方向减少。稳定期（稳定期（stationary phase）细胞数稳定，细胞数稳定，其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、其特征为细胞高液泡化、极度脆弱、高度分化，有机化合物的浓度高。高度分化，有机化合物的浓度高。第34页，讲稿
34、共86张，创作于星期二由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取由上所述可以知道，植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。决于对数期，而次级代谢产物的累积则主要在稳定期完成。当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容，当然植物细胞与哺乳动物细胞及微生物细胞有很多的不容，并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传并由此导致了一系列生理生化等方面的差异，比如混合与传质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而质等。就植物细胞而言，它们很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。根据细胞系的来源、多以非均相集合体的
35、细胞团形式存在。根据细胞系的来源、培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在培养基及培养时间等的不同，细胞团的细胞数目在2200 之间，直径为之间，直径为2mm左右。左右。第35页，讲稿共86张，创作于星期二细胞团产生的原因有两个：（细胞团产生的原因有两个：（1）细胞分裂之后没）细胞分裂之后没有进行细胞分离；（有进行细胞分离；（2）在间歇培养过程中细胞处于对）在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其数生长后期时，开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。它形式形成粘性表面，从而形成细胞团。植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使
36、植物细胞形态上的另一特性，就是其纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再故传统的搅拌式生物反应器容易损坏植物细胞的细胞壁。再者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间的延长，细者，植物细胞培养基黏度度比较高，且培养时间的延长，细胞数量呈指数上升。胞数量呈指数上升。第36页，讲稿共86张，创作于星期二所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不所有的植物都是好气性的，因此培养过程中需要不断地供氧。但是，与微生物细胞相反，它并不需要很高断地供氧。但是，与微生物细胞相
37、反，它并不需要很高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的氧水平。此外，大多数植物细胞液体培养的pH为为57，在，在此此pH水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞水平，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的生长，这个问题可通过在通气过程中加入一定浓度的二氧化碳来解决。注意光照的影响。二氧化碳来解决。注意光照的影响。第37页，讲稿共86张，创作于星期二植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞植物细胞液体培养过程中的泡沫问题不象微生物细胞培养时那么严重
38、，泡沫的性质也不同。气泡比微生物培养培养时那么严重，泡沫的性质也不同。气泡比微生物培养系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，系统中的大，而且由于其含有蛋白质或粘多糖，黏度较大，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，细胞极易被包埋在泡沫中，并从循环的营养液中带出来，这就造成了非均相培养，通常需要采用化学或机械的方法这就造成了非均相培养，通常需要采用化学或机械的方法加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培加以控制，否则，随着泡沫和细胞数量的增加，混合和培养过程的稳定性就要受到影响。养过程的稳定性就要受到影响。第38页，讲稿共86张，创作于星期二在植物细胞液体培养
39、过程中，细胞可能会黏附于培养的在植物细胞液体培养过程中，细胞可能会黏附于培养的反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表面的黏附及其在反应器壁、电极或挡板的表面上。细胞对表面的黏附及其在器壁上的生长特性，是人们目前正在研究的重点课题之一。器壁上的生长特性，是人们目前正在研究的重点课题之一。通过改变培养基中某些离子的成分，可使表面吸附问题得到通过改变培养基中某些离子的成分，可使表面吸附问题得到一定程度的改善。一定程度的改善。第39页，讲稿共86张，创作于星期二第三节 植物细胞培养的基本技术一、植物材料的准备一、植物材料的准备用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微用于植物组织培养的外植体，必须
40、是无杂菌材料。微生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因此需灭菌处理。此需灭菌处理。许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的时间试剂。第40页，讲稿共86张，创作于星期二灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经不宜过长；
41、而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。常使用的灭菌剂如下表。灭菌剂灭菌剂使用浓度使用浓度/%去除难易程度去除难易程度灭菌时间灭菌时间/min效果效果次氯酸次氯酸 钙钙次氯酸钠次氯酸钠过氧化氢过氧化氢溴溴 水水硝硝 酸酸 银银氯氯 化化 汞汞抗抗 生生 素素9 100.5 53121210.11450mg/L易易易易最易最易易易较难较难较难较难中中5305305152105302103060很好很好很好很好好好很好很好好好最好最好较好较好第41页，讲稿共86张，创作于星期二组织（器组织（器官）官）灭菌步骤灭菌步骤备注备注灭菌前处理灭菌前处理灭菌灭菌灭菌后处理灭菌后处理种子种子
42、纯酒精中浸纯酒精中浸10min，再用，再用无菌水漂洗无菌水漂洗100g/L次氯酸次氯酸钙浸钙浸2030min，再用，再用10g/L溴水浸溴水浸5min无菌水洗无菌水洗3次，次，在无菌水中发在无菌水中发芽；或无菌水芽；或无菌水洗洗5次，在湿无次，在湿无菌纸上发芽菌纸上发芽用幼根或幼芽发用幼根或幼芽发生愈伤组织生愈伤组织果实果实纯酒精漂洗纯酒精漂洗20g/L次氯酸次氯酸钠浸钠浸10min无菌水冲洗，无菌水冲洗，再剖除内部组再剖除内部组织的种子织的种子获得无菌苗获得无菌苗茎切段茎切段自来水洗净，自来水洗净，再用酒精洗再用酒精洗20g/L次氯酸次氯酸钠浸钠浸530min无菌水洗无菌水洗3次次储藏器官储
43、藏器官自来水自来水20g/L次氯酸次氯酸钠浸钠浸2030min无菌水洗无菌水洗3次，次，滤纸吸干滤纸吸干叶片叶片自来水，吸干，自来水，吸干，纯酒精纯酒精1g/L氯化汞浸氯化汞浸1min无菌水反复冲无菌水反复冲洗，滤纸吸干洗，滤纸吸干选取嫩叶、叶片选取嫩叶、叶片平放在琼脂上平放在琼脂上植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤植物不同组织（器官）的灭菌时间和步骤第42页，讲稿共86张，创作于星期二植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的植物材料灭菌后，即可进行培养。接种的外植体的形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果形状和大小要根据试验目的及具体情况而定。当然，如果所用外植体细胞多时，
44、得到愈伤组织的机会必然也多。如所用外植体细胞多时，得到愈伤组织的机会必然也多。如要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且要定量研究愈伤组织，则不仅外植体的大小要一致，而且其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常其形状及组织部位也应基本类似。进行这类培养研究常常选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯选用较大材料，如人参、胡萝卜或甜菜的贮藏根、马铃薯的块茎等。的块茎等。第43页，讲稿共86张，创作于星期二二、培养基及其组成二、培养基及其组成培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的培养基实际上是植物离体器官、组织或细胞等的无菌土壤，其特点是营养成分的可调控性。无菌土
45、壤，其特点是营养成分的可调控性。植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都植物组织和细胞培养所用培养基种类较多，但通常都含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学成分。有商品化的培养基可以购买。化学成分。有商品化的培养基可以购买。第44页，讲稿共86张，创作于星期二1.无机盐无机盐基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，这基本培养基是由各种浓度的无机盐溶液组成的，这些无机盐又有些无机盐又有“大量元素大量元素”和和“微量元素微量元素”之分。大量之分。大量元素是指使用浓度大于元素是指使用浓度大于30mg/L时的无机元素，包括时的无
46、机元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和钠，而微量元素是指浓度低于和钠，而微量元素是指浓度低于30mg/L的无机元素，如的无机元素，如Fe、B、Mn、I和和Mo，以及极微，以及极微量的量的Cu和和Zn。某些情况下，还可加入。某些情况下，还可加入Ni、Co和和Al。这些微。这些微量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，如镍对脲酶量元素作为辅因子或对酶合成而言，都是必须的，如镍对脲酶的合成就是至关重要的。的合成就是至关重要的。第45页，讲稿共86张，创作于星期二2.碳源碳源植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使用植物细胞培养物通常均为异养细胞。因此人们经常使用碳水化合物、肌醇作为
47、碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等碳水化合物、肌醇作为碳源，有时也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，化合物。有些培养物还可通过同化二氧化碳而获得所需的能量，此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养基固化剂也可作为此所谓光自养培养物。在某些情况下，培养基固化剂也可作为补充能量和碳源之用。补充能量和碳源之用。此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重此外，某些天然提取物对愈伤组织的诱导和培养也有重要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为要意义，如椰子乳（椰子的液体胚乳），常用浓度为10%；也；也可用可用0.5%的酵母提取物或的酵母提取物或5%1
48、0%的番茄汁等。的番茄汁等。第46页，讲稿共86张，创作于星期二3.植物生长调节剂植物生长调节剂植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在植物激素是指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（极低浓度（1 M）时即能调节植物的生育过程，并能从合成）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素只限于天然产生的调节物质，到目前位置，已发现植物组织中可以形成调节物质，到目前位置，已发现植物组织中可以形成5种植物种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。植激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯
49、。植物生长调节剂既包括人工合成的具有生理活性的化合物，物生长调节剂既包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。也包括一些天然的化合物以及植物激素。第47页，讲稿共86张，创作于星期二4.有机氮源有机氮源使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）使用较多的有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺）或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的或各种氨基酸。有机氮源对细胞的早期生长有利，氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源的供应，但应注意的是苏氨加入主要是为了代替或增加氮源的供应，但应注意的是苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷酸、甘氨酸和
50、缬氨酸可通过灭活位于叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活氨酸合成酶而降低氮的利用，而精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。作用的能力。第48页，讲稿共86张，创作于星期二5.维生素维生素植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情况下，其植物细胞通常是维生素自养型的，但在大多数情况下，其自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即使是光合成活性自身合成的量均不能满足植物细胞的需要，即使是光合成活性细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必需加入细胞或组织也是如此。故对大多数培养基而言，除了必需加入的的B族维生素（如族维生素（如B1、B6和泛酸）外，通常还需加入