真核基因表达系统.pptx

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1、概述概述(introduction)真核基因结构及表达调控特点真核基因结构及表达调控特点(Features of eukaryotic gene structure and regulation)真核表达系统真核表达系统(eukaryotic gene expression system)酵母表达系统酵母表达系统(yeast expression system)哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统(insect cell expression)内内 容容第1页/共97页第一节第一节 概述概述一、真核基因组

2、的复杂性一、真核基因组的复杂性二、原核表达系统的局限性二、原核表达系统的局限性三、真核表达系统的必要性及优势三、真核表达系统的必要性及优势第2页/共97页一、真核基因组的复杂性一、真核基因组的复杂性 1.真核基因组巨大真核基因组巨大 大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因2.真核生物遗传信息复杂真核生物遗传信息复杂 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。第3页/共97页 细

3、菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。3.真核生物基因协调表达真核生物基因协调表达第4页/共97页4.真核生物基因编码复杂真核生物基因编码复杂原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅

4、约哺乳类基因组中仅约10%10%的序列为蛋白质、的序列为蛋白质、rRNArRNA、tRNAtRNA等编码，等编码，其余约其余约90%90%的序列功能至今还不清楚。的序列功能至今还不清楚。原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)(exon)和内含子和内含子(intron)(intron)，转录后需经剪接，转录后需经剪接(splicing)(splicing)去除内去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了

5、基因表达调控的含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。环节。原核基因组中除原核基因组中除rRNArRNA、tRNAtRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive(repetitive sequences)sequences)。真核生物真核生物mRNA 5mRNA 5有帽状结构，有帽状结构，33末端有末端有PolyAPolyA尾巴尾巴 第5页/共97页1、没有转录后的剪接和加工系统、没有转录后的剪接和加工系统 2、缺乏翻译后加工修饰系统：、缺乏翻译后加工修饰系

6、统：不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。些蛋白的活性。二、二、原核表达系统的局限性原核表达系统的局限性第6页/共97页3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定 易被细菌蛋白酶降解易被细菌蛋白酶降解;难实现真正的分泌出胞，其产量很低难实现真正的分泌出胞，其产量很低;而且而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低4、内毒素的污染、内毒素的污染(co

7、ntamination of endotoxin)第7页/共97页1.具转录后加工系统具转录后加工系统:2.具翻译后修饰系统具翻译后修饰系统3.可实现真正的分泌表达可实现真正的分泌表达三三、真核表达系统的必要性及优势、真核表达系统的必要性及优势 (advantages of eukaryotic expression system)第8页/共97页（一）真核基因表达调控特点（一）真核基因表达调控特点 -多层次、多方面多层次、多方面（二）真核基因表达的调控模式（二）真核基因表达的调控模式第二节第二节 真核基因表达调控特点真核基因表达调控特点Features of Eukaryotic gene

8、structure and expression第9页/共97页真核基因表达的调控模式真核基因表达的调控模式(The regulating model of eukaryotic gene expression)1、转录前水平、转录前水平(基因组水平基因组水平)：gene level 2、转录水平调控、转录水平调控:transcription level3、转录后调控、转录后调控:post-transcription level4、翻译水平的调控、翻译水平的调控:translation level5、翻译后修饰、翻译后修饰:post-translation modification 第10页/

9、共97页1、转录前水平、转录前水平(基因组水平基因组水平)：gene level 基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，DNA甲基化等甲基化等第11页/共97页2.转录水平调控转录水平调控 顺式调控元件顺式调控元件(cis-acting element)反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor)第12页/共97页（1）顺式调控元件顺式调控元件(cis-acting element)结构基因周围能与特异转录因子结合而启动结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的转录的DNA序列，主要包括序列，主要包括：起正性调节作

10、用：启动子、增强子起正性调节作用：启动子、增强子起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号第13页/共97页 启动子启动子 位于基因位于基因55末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括核心启动子元件（核心启动子元件（core promoter elements)core promoter elements)：指指RNARNA聚合酶起始转录所必需的最小的聚合酶起始转录所必需的最小的DNADNA序列，决定基因转序列，决定基

11、因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-3030区的区的TATA-boxTATA-box上游启动子元件（上游启动子元件（upstream promoter elementsupstream promoter elements)包包括括 -70-70到到-80bp-80bp区区域域的的CAATCAAT盒盒及及其其两两侧侧的的GCGC盒盒，协协同同决决定定转录的基础效率转录的基础效率组织特异性元件组织特异性元件诱导性启动子元件诱导性启动子元件第14页/共97页真核启动子结构模式图真核启动子结构模式图核心启动子元件上游启动子元

12、件第15页/共97页 哺乳类哺乳类RNA聚合酶聚合酶启动子中常见的元件启动子中常见的元件元件名称元件名称共同序列共同序列结合的蛋白因子结合的蛋白因子名称名称 分子量分子量 结合结合DNA长度长度TATA boxTATAAAATBP 30,000 10bpGC box GGGCGGSP-1 105,000 20bpCAAT boxGGCCAATCTCTF/NF1 60,000 22bpOctamerATTTGCATOct-1 76,000 20bpOct-2 53,000 23bpk BGGGACTTTCCNFkB 44,000 10bpATFGTGACGTAFT?20bp第16页/共97页 增

13、强子增强子(enhancer)是一种能够提高转录效率的顺式调控元件是一种能够提高转录效率的顺式调控元件增增强强子子要要有有启启动动子子才才能能发发挥挥作作用用，但但增增强强子子对对启启动子没有严格的专一性动子没有严格的专一性 无方向性（序列、位置）无方向性（序列、位置）远距离作用（远距离作用（1-4kB）无基因特异性无基因特异性具组织特异性具组织特异性构建载体构建载体第17页/共97页沉寂子（沉寂子（silencer)silencer)或衰减子（或衰减子（dehancer)dehancer)是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式 与增强子相同转录终止信号：转录终止信号：控制基因转录的终止，由p

14、olyA上游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成 第18页/共97页（2）反式作用因子）反式作用因子(trans-acting factor)由位于不同或相同染色体上相距较远的由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和元件和RNA聚合酶的聚合酶的相互作用相互作用而调节基因转而调节基因转录活性。录活性。第19页/共97页转录信号转录信号1PTrans-acting factorTrans-acting factor(DNA结合蛋白）结合蛋白）Cis-acting factorA gen

15、emRNA of AProtein AB genemRNA of BProtein BDNA第20页/共97页3 3、转录后的修饰、转录后的修饰内含子的剪接内含子的剪接外显子的拼接外显子的拼接mRNAmRNA的加尾和加帽的加尾和加帽mRNAmRNA的稳定性的稳定性第21页/共97页 4 4、翻译水平的调控、翻译水平的调控 主要是主要是microRNAmicroRNA对对mRNAmRNA、tRNA tRNA 和和rRNArRNA的调控的调控第22页/共97页5 5、翻译后的调控、翻译后的调控 切除信号肽切除信号肽 糖基化糖基化 乙酰化乙酰化 磷酸化磷酸化 甲基化甲基化 蛋白质的降解蛋白质的降解第

16、23页/共97页第三节第三节 真核表达系统真核表达系统组成：组成：真核表达载体真核表达载体 受体细胞受体细胞第24页/共97页真核表达载体真核表达载体 适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。真核载体根据受体不同，又可分为几种：真核载体根据受体不同，又可分为几种：酵母表达载体酵母表达载体 哺乳动物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体昆虫杆状病毒表达载体昆虫杆状病毒表达载体第25页/共97页受体细胞受体细胞据受体细胞及表达载体的不同分为据受体细胞及表达载体的不同分为3 3种：种：酵母表达系统酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统昆虫细胞表达系统昆虫细

17、胞表达系统第26页/共97页发酵简单、快速、便宜发酵简单、快速、便宜真核生物，有翻译后修饰功能真核生物，有翻译后修饰功能可分泌表达，简化了纯化工艺可分泌表达，简化了纯化工艺受体细胞安全受体细胞安全一、酵母表达系统一、酵母表达系统第27页/共97页（一）酵母载体（一）酵母载体:1 1、概念：、概念：携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增 和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。2 2、组成元件、组成元件：遗传标记：遗传标记 调控序列调控序列第28页/共97页1 1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定

18、营养标记基因：亮氨酸（营养标记基因：亮氨酸（LeuLeu）抗生素选择标记基因：抗生素选择标记基因：ZeocinZeocin第29页/共97页 2）调控序列）调控序列ARS：酵母复制起始区：酵母复制起始区(点点)酵母启动子：常用的有酵母启动子：常用的有:PGK(磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶)GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）磷酸甘油醛脱氢酶）ADH1(醇脱氢酶醇脱氢酶)SUC(蔗糖酶蔗糖酶)Apase(碱性磷酸酶碱性磷酸酶)酵母着丝粒区段酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性：增加转化子稳定性第30页/共97页 3 3、类型、类型(types)(types)酵母克隆载体酵母克隆载体(yeast cl

19、one vector)：不含酵母启动子，不能在酵不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如母中表达外源基因，如YIPYIP、YRPYRP、YEPYEP 酵母表达载体酵母表达载体(yeast expression vector)：酵母克隆载体酵母克隆载体+酵母启酵母启动子动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体若引入信号肽序列，则成为分泌型载体 酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)克隆大片段克隆大片段DNADNA，2M质粒质粒：酵母核质中的小的环状酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。，可以独立复制并转录。第31页/共97页

20、（1）酵母克隆载体的构建）酵母克隆载体的构建酵母整合型质粒酵母整合型质粒(yeast integrated plasmid.Yip)(yeast integrated plasmid.Yip)细菌质粒细菌质粒DNA+DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低染色体，转化子稳定，但转化率极低。酵母复制型质粒酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid,YRp)(Yeast replicable plasmid,YRp)细菌质粒细菌质粒DNA+DNA+酵母遗传标记酵母遗传标记(YIp)+(YIp)+酵母复制序

21、列酵母复制序列(ARS(ARS),),可自主复制，但稳定性差可自主复制，但稳定性差酵母附加子型质粒酵母附加子型质粒,YEp,YEp ：细菌质粒：细菌质粒DNA+DNA+酵母标记基因酵母标记基因(YIp)+(YIp)+酵母酵母2 2MM质粒质粒，游离于核外存在并自主复制，游离于核外存在并自主复制第32页/共97页酵母复制序列酵母2M质粒第33页/共97页（2）酵母表达载体）酵母表达载体特点特点：含酵母启动子：含酵母启动子 穿梭载体穿梭载体(shuttle vector)：既可以既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。在真核细胞

22、中表达的载体。种类种类：啤酒酵母表达载体：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体：毕赤酵母表达载体：分泌型表达载体分泌型表达载体 非分泌型表达非分泌型表达第34页/共97页啤酒酵母表达载体啤酒酵母表达载体第35页/共97页毕赤酵母表达载体毕赤酵母表达载体-整合型整合型第36页/共97页(3)(3)酵母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial yeast artificial chromosome,YAC)-chromosome,YAC)-克隆大片段克隆大片段DNADNA 由下列元件组成由下列元件组成 酵母染色体酵母染色体 2umDNA 2umDNA的复制起始区的复制起始区 着丝

23、粒序列（着丝粒序列（CEN)CEN)四膜虫端粒四膜虫端粒DNA(TEL)DNA(TEL)第37页/共97页YAC:利用酵母的着丝粒区段（利用酵母的着丝粒区段（CEN）、自动复制序列）、自动复制序列（ARS）及）及四膜虫端粒四膜虫端粒DNA(TEL)DNA(TEL)构建的人工染色体构建的人工染色体结构：结构：左臂：左臂：TEL、选择标记、选择标记、ARS、CEN 右臂：右臂：TEL、选择标记、选择标记特点：容量大（特点：容量大（50-1000kb），稳定性差），稳定性差作用：构建基因组文库作用：构建基因组文库第38页/共97页第39页/共97页 二）受体细胞二）受体细胞 1.1.啤酒酵母：啤酒酵

24、母：较早使用，了解清楚较早使用，了解清楚 安全性高，被安全性高，被FDAFDA确认为安全生物确认为安全生物 表达量较低表达量较低 过量糖基化过量糖基化 转化子不稳定，易发生质粒丢失转化子不稳定，易发生质粒丢失第40页/共97页2.毕赤酵母：毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞新发展的酵母受体细胞高表达（高表达（12g/L）高稳定高稳定-载体为整合型载体为整合型高分泌（高分泌（10g/L）第41页/共97页三）三）转化转化 1.原生质体法：去除厚壁原生质体法：去除厚壁 2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化切线性化3.LiCl法：做成感受态细胞法：

25、做成感受态细胞第42页/共97页四）外源基因在酵母菌中的表达四）外源基因在酵母菌中的表达1 1、胞内表达：、胞内表达：直接表达外源基因，直接表达外源基因，如：如：HBsAgHBsAg的酵母重组疫苗的酵母重组疫苗2 2、分泌表达：、分泌表达：在在MCS前加入信号肽序列，前加入信号肽序列，pGAPZ,利用利用 因子分泌因子分泌表达表达第43页/共97页 五）高表达的策略五）高表达的策略（1 1）利利用用诱诱导导型型强强启启动动子子：毕毕赤赤酵酵母母表表达达载载体体中中常常用用启启动动能力强的能力强的GAPGAP启动子启动子（2 2）提提高高整整合合拷拷贝贝数数：可利利用用载载体体中中提提供供的的抗

26、抗生生素素遗遗传传标标记，以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子记，以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。（3 3）控控制制蛋蛋白白酶酶降降解解活活性性：采采用用蛋蛋白白酶酶缺缺陷陷型型宿宿主主菌菌，改改变变发发酵酵培培养养基基的的PHPH值值，或或在在培培养养基基中中补补加加氨氨基基酸酸或或多多肽肽，均可避免产物被降解均可避免产物被降解。（4 4）分泌表达：）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略也是一种避免产物被降解的良好策略。第44页/共97页酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid System第45页/共97页 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母双杂交系统是在真核模

27、式生物酵母酵母中进行的，研中进行的，研究究活细胞内活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过的作用也能通过报告基因报告基因的表达产物敏感地检测得到。的表达产物敏感地检测得到。1989年美国纽约州立大学的年美国纽约州立大学的Fields和和Song首先描述首先描述了酵母双杂交系统了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵。蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。因子之间的相互作用对真核基因

28、转录调控影响的实验。第46页/共97页很早就已知道，转录活化蛋白可以和很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即结构域即DNA 结合结构域结合结构域(Binding Domain,BD)和转和转录活化结构域录活化结构域(Activation Domain,AD)分别来完成的，分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的 转录激活因

29、子转录激活因子DNA结合结构域结合结构域(BD)(DNA binding domain)转录激活结构域转录激活结构域(AD)(activation domain)第47页/共97页 这两个结构域各具功能，互不影响这两个结构域各具功能，互不影响,单独存单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。整的激活特定基因表达的激活因子的功能。第48页/共97页 基基本本原原理理 在在利利用用GAL4 系系统统筛筛选选cDNA 文文库

30、库或或研研究究蛋蛋白白间间的的相相互互作作用用时时，DNA 结结合合结结构构域域与与靶靶蛋蛋白白即即“诱诱饵饵”相相结结合合，转转录录活活化化结结构构域域与与文文库库蛋蛋白白或或要要验验证证的的蛋蛋白白相相结结合合。一一般般情情况况下下，单单独独的的BD 可可以以与与GAL4 上上游游活活化化序序列列（GAL UAS）结结合合但但不不能能引引起起转转录录，单单独独的的AD 则则不不能能与与GAL UAS 结结合合，只只有有当当BD 与与AD 分分别别表表达达的的融融合合蛋蛋白白由由于于相相互互作作用用而而导导致致两两者者在在空空间间上上相相互互靠靠近近时时，BD 与与AD 才才能能与与GAL

31、UAS 结结合合并并且且引引起起报报道道基基因因的的转转录录。第49页/共97页ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS)reporter geneXDNA-BDtranscriptiontranscription已知蛋白X与BD-fusion -诱饵（bait）未知蛋白Y与AD-fusion -猎物或靶蛋白（prey or target protein）报告基因（r

32、eporter gene）-Lac Z（编码-半乳糖苷酶）第50页/共97页第51页/共97页第52页/共97页第53页/共97页LacZ reporter-Blue/White ScreeningHIS3 reporter-Screen on His+media(usually need to add 3AT to increase selectivity)LEU2 reporter-Screen on Leu+mediaADE2 reporter-Screen on Ade+mediaURA3 reporter-Screen on Ura+media(can do negative sel

33、ection by adding FOA)报告基因报告基因第54页/共97页已知蛋白的已知蛋白的cDNAcDNA序列为诱饵序列为诱饵(bait)(bait)，将其与，将其与DNADNA结合域（结合域（BDBD）融合，构建成诱饵质粒融合，构建成诱饵质粒将待筛选蛋白的将待筛选蛋白的cDNAcDNA序列与转录激活域序列与转录激活域(AD)(AD)融合，构建成融合，构建成文库质粒文库质粒将这两个质粒共转化于酵母细胞中将这两个质粒共转化于酵母细胞中酵母细胞中，已分离的酵母细胞中，已分离的DNADNA结合域和转录激活域不会相互作用，结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相

34、互作用，则可激但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录活报告基因的转录第55页/共97页第56页/共97页酵母双杂交系统的优点酵母双杂交系统的优点 高敏感性。高敏感性。真实性。真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。简洁性。简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。纯化蛋白质的繁琐步骤。广泛性。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料

35、构建材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。蛋白。第57页/共97页 分析已知蛋白之间的相互作用分析已知蛋白之间的相互作用 对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。突变或缺失突变再进行双杂交。用已知功能蛋白质筛选双杂交用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。分析新基因的生物学功能。即以功能未知的

36、新基因分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。绘制蛋白质相互作用系统图谱绘制蛋白质相互作用系统图谱 在药物设计中的应用在药物设计中的应用酵母双杂交系统的应用现状酵母双杂交系统的应用现状第58页/共97页进行完全的翻译后修饰进行完全的翻译后修饰可表达产生有功能的膜蛋白可表达产生有功能的膜蛋白用途：表达大量的外源蛋白用途：表达大量的外源蛋白 研究基因的功能研究基因的功能 基因治疗基因治疗两部分：两部分：哺乳动物表达载体哺乳动物表达载体 受体：哺乳动物细胞受体：哺乳动物细胞二、哺乳动物细胞表达系统二、哺乳

37、动物细胞表达系统第59页/共97页1 1、主要元件主要元件2 2、载体的类型、载体的类型 非病毒性载体非病毒性载体 病毒性载体病毒性载体 一）哺乳动物细胞表达载体一）哺乳动物细胞表达载体第60页/共97页(一）主要元件一）主要元件1）启动子）启动子 病毒来源的病毒来源的：SV40:绿猴空泡病毒（绿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus-40）CMV:巨细胞病毒（巨细胞病毒（Cytomegalovirus）RSV:肉瘤病毒（肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）ADV:adenovirus （腺病毒）（腺病毒）LTR:逆转录病毒长末端重复序列（逆转录病毒长末端重复

38、序列（Long terminal repeat from retrovirus）细胞来源的细胞来源的：HSP：heat shock protein（热休克蛋白）（热休克蛋白）第61页/共97页(Promoter+ori)(PolyA)ori第62页/共97页2）增强子）增强子 许多来源于病毒的许多来源于病毒的增强子增强子在不同种属细胞中都有极在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力强的促进转录能力 SV40 enhancer RSV enhancer CMV enhancer LTR enhancer第63页/共97页3 3）筛选标记）筛选标记胸苷激酶胸苷激酶(tk)基因基因 Thymidine

39、 kinase gene二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶(dhfr)基因基因 Dihydrofolate reductase,dhfr新霉素抗性基因新霉素抗性基因 neomycin resistance gene第64页/共97页胸苷激酶胸苷激酶(tk)(tk)基因基因tk+细胞细胞中：胸苷中：胸苷(T)胸苷一磷酸胸苷一磷酸二氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 四氢叶酸四氢叶酸 dCTPdATP dTTP氨基喋呤氨基喋呤(Aminopterin)tk阻断阻断补加次黄嘌呤（补加次黄嘌呤（Hypoxanthine）死死亡亡存存活活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）H

40、AT第65页/共97页二氢叶酸还原二氢叶酸还原酶基因筛选法原理酶基因筛选法原理携带外源基因的载体连接有携带外源基因的载体连接有dhfr基因基因，可以表达二氢叶酸还原，可以表达二氢叶酸还原酶酶以以dhfr-细胞为受体细胞为受体:CHO细胞细胞dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以基因后可以存活，并表达外源基因。存活，并表达外源基因。若在培养基内加入若在培养基内加入甲氨蝶呤甲氨蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量因表达量第66页/共97页新霉素的类似物新霉素的类似物G418对原核、真核均有毒对原核、真

41、核均有毒neo编码的酶可使编码的酶可使G418灭活灭活此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便此种筛选方法对受体细胞无要求，应用更简便新霉素抗性基因新霉素抗性基因(neo)(neo)第67页/共97页4）转录终止信号和多聚腺苷酸信号）转录终止信号和多聚腺苷酸信号 使转录后的使转录后的mRNA 能有效进行切割和多聚腺苷酸化能有效进行切割和多聚腺苷酸化第68页/共97页多聚腺苷多聚腺苷酸信号酸信号第69页/共97页5 5）复制元件：）复制元件：使载体在受体细胞中复制，使载体在受体细胞中复制，提高外源基因的表达水平提高外源基因的表达水平6 6）原核细胞的部分序列）原核细胞的部分序列 在原核细胞复制的

42、复制起始为点（在原核细胞复制的复制起始为点（ori)ori)在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因（在原核细胞复制筛选的抗生素抗性基因（AMPrAMPr）第70页/共97页复制元件复制元件复制元件复制元件第71页/共97页 1 1）非病毒性载体）非病毒性载体 2 2）病毒性载体：腺病毒，慢病毒等）病毒性载体：腺病毒，慢病毒等2、载体的类型载体的类型第72页/共97页1）非病毒型）非病毒型(复制子型复制子型,质粒型）质粒型）由真核复制信号、启动子由真核复制信号、启动子,转录单位及质粒片段组成转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。不需要包装细胞。如：如：pSV系列、系列、pCDNA3等等(二）载体的

43、类型二）载体的类型第73页/共97页第74页/共97页2）病毒型载体）病毒型载体 外源外源DNA插入病毒插入病毒DNA或取代病毒基因某或取代病毒基因某一片段，重组一片段，重组DNA随病随病毒颗粒而复制毒颗粒而复制(多需辅助多需辅助病毒或包装细胞的存在病毒或包装细胞的存在)。如：如：逆转录病毒载体逆转录病毒载体、腺腺病毒载体病毒载体等等第75页/共97页病毒型载体的类型病毒型载体的类型整合型整合型 整合入宿主染色体，随染色体复制而复制整合入宿主染色体，随染色体复制而复制 可持续表达外援基因可持续表达外援基因 安全性低：插入诱变安全性低：插入诱变 SV40SV40载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体载

44、体、逆转录病毒载体、慢病毒载体游离型游离型 不整合不整合 生物安全性高生物安全性高 瞬时表达瞬时表达 腺病毒载体、痘苗病毒载体腺病毒载体、痘苗病毒载体第76页/共97页1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）-可大规模培养可大规模培养2、COS细胞（猴肾细胞系）：可合成细胞（猴肾细胞系）：可合成SV40复制的大复制的大T抗原，可使每个细胞中的抗原，可使每个细胞中的SV40载体拷贝数多达载体拷贝数多达10万个，适合于大量表达万个，适合于大量表达SV40载体上的基因载体上的基因3、其他动物的细胞：、其他动物的细胞：如如Hela细胞（人宫颈癌细胞）、细胞（人宫颈癌细胞）、HEK

45、293细胞细胞二）受体细胞二）受体细胞-哺乳动物细胞哺乳动物细胞第77页/共97页三）基因转移技术三）基因转移技术转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组转化：将质粒或以质粒为载体构建的重组DNA导入导入细胞的方法。细胞的方法。1.磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 2.DEAE-Dextran 3.脂质体转染法：脂质体转染法：4.电穿孔法电穿孔法 5.显微注射法显微注射法 6.受体介导的基因转移方法受体介导的基因转移方法转染：将病毒或以病毒为载体构建的重组转染：将病毒或以病毒为载体构建的重组DNA导入导入细胞的方法细胞的方法第78页/共97页脂质体介导的基因转移脂质体介导的基因转移脂质体脂质体(Lip

46、osome)介导：介导：Lipid/DNA complex脂质体的特性脂质体的特性：对温度、对温度、pH敏感敏感带正电荷，与基因的复合过程比较容易带正电荷，与基因的复合过程比较容易脂质体与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂脂质体与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质体即被降解质体即被降解无免疫原性，保护无免疫原性，保护DNA不被降解不被降解对包裹的对包裹的DNA大小没有限制大小没有限制转染过程方便易行，重现性好转染过程方便易行，重现性好第79页/共97页第80页/共97页四）哺乳动物细胞表达系统的缺点：四）哺乳动物细胞表达系统的缺点：需要组织培养需要组织培养筛选时间长筛选时间长价格昂贵价格昂贵

47、第81页/共97页应用：应用：1、蛋白质在细胞中的定位、蛋白质在细胞中的定位发光基因（GFP，RFP）免疫荧光第82页/共97页第83页/共97页第84页/共97页TRIM38 localizes in aggresome第85页/共97页TRIM38 localizes in aggresome第86页/共97页TLR-induced hnRNP U nuclear to cytoplasmic translocation第87页/共97页应用：应用：2、Co-immunoprecipitation(IP)研究蛋白与蛋白的相互作用第一个蛋白的抗体pull-down蛋白复合物，利用第二个蛋白质

48、的抗体做WB，如果可检测到第二个蛋白，就证明第一个蛋白可与第二个蛋白相互作用。第88页/共97页TRIM38 interacts with TRAF6 through PRY/SPRY 第89页/共97页容量大，可同时表达多种外源基因容量大，可同时表达多种外源基因具强启动子具强启动子具有易识标志具有易识标志具有良好翻译后修饰具有良好翻译后修饰安全性高安全性高三、昆虫杆状病毒表达系统三、昆虫杆状病毒表达系统第90页/共97页1、昆虫杆状病毒、昆虫杆状病毒许多农林业昆虫的天敌，对人无寄生能力，安全性高。许多农林业昆虫的天敌，对人无寄生能力，安全性高。基因组特点：基因组特点：Baculovirus基

49、因组庞大基因组庞大,100-150Kb 具具有有复复制制非非必必需需区区，可可用用于于改改造造为为基基因因工工程程载载体体（多多角体蛋白编码序列、角体蛋白编码序列、P10蛋白序列蛋白序列）一、昆虫杆状病毒载体一、昆虫杆状病毒载体第91页/共97页2、杆状病毒载体、杆状病毒载体-转移载体转移载体转移载体（转移载体（transfer vector):同时含有原核序同时含有原核序列列(复制起始信号、抗性基因复制起始信号、抗性基因)和病毒基因组和病毒基因组序列的载体序列的载体,除可携带外源基因在原核中复制、除可携带外源基因在原核中复制、扩增外，还可通过细胞内同源重组，将外源扩增外，还可通过细胞内同源重组，将外源基因插入病毒基因组，构建重组病毒基因插入病毒基因组，构建重组病毒。第92页/共97页 基本元件基本元件：原核序列：原核序列：ori、抗性基因、抗性基因 杆状病毒启动子杆状病毒启动子 杆状病毒重组必需区杆状病毒重组必需区 MCS第93页/共97页多角体蛋白多角体蛋白启动子启动子第94页/共97页3、受体细胞、受体细胞1）sf（秋粘虫）细胞（秋粘虫）细胞2）Bm（家蚕）细胞（家蚕）细胞3）昆虫幼虫）昆虫幼虫二、受体细胞二、受体细胞第95页/共97页第96页/共97页感谢您的观看！第97页/共97页