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1、关于植物基因工程_抗虫抗病基因第1页，讲稿共139张，创作于星期二第一章抗植物病虫害基因及其应用第一节抗植物虫害基因及其应用第二节抗植物病毒基因及其应用第三节抗植物真菌病害基因及其应用第四节抗植物细菌病害基因及其应用第2页，讲稿共139张，创作于星期二第一节概述一、作用及意义二、抗性基因的来源三、抗性基因分类第3页，讲稿共139张，创作于星期二一、作用及意义应用抗病虫害基因具有以下优势：应用抗病虫害基因具有以下优势：1.1.育种周期短、效率高、成本低。育种周期短、效率高、成本低。2.2.提高产量和品质。提高产量和品质。3.3.降低生产成本。降低生产成本。4.4.防止化学农药污染，避免破坏生态平
2、衡。防止化学农药污染，避免破坏生态平衡。5.5.克服亲本基因资源缺乏。克服亲本基因资源缺乏。6.6.抗性性状具有连续性和整体性。抗性性状具有连续性和整体性。第4页，讲稿共139张，创作于星期二二、抗性基因的来源 根据基因来源分为三类：1.植物组织如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。2.动物如杀菌肽（cecropins）基因。3.微生物如Bt杀虫结晶蛋白基因。第5页，讲稿共139张，创作于星期二三、抗性基因分类据基因的作用功能和对象分为：1.抗虫基因。2.抗病毒基因。3.抗真菌和细菌基因。第6页，讲稿共139张，创作于星期二第二节抗植物虫害基因及其应用一、Bt基因及其应用二、蛋白酶抑制剂基因及其应用三、植
3、物凝集素基因及其应用四、淀粉酶抑制剂基因及其应用第7页，讲稿共139张，创作于星期二一、Bt基因及其应用 1.Bt基因的作用原理2.2.ICP的分类、结构及抗虫谱3.Bt基因的应用4.存在的问题及对策第8页，讲稿共139张，创作于星期二1.Bt基因的作用原理 BtBt基因：基因：是从微生物苏云金杆菌（是从微生物苏云金杆菌（Bacillus thu-Bacillus thu-ringicnsisringicnsis）分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因）分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因，简简称称BtBt基因。基因。苏云金杆菌属于革兰氏阴性，形成孢子细菌。在芽胞形苏云金杆菌属于革兰氏阴性，形成孢子
4、细菌。在芽胞形成过程中，可产生伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成，成过程中，可产生伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成，具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白通常被称作具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白通常被称作-内毒内毒素（素（-endotoxins-endotoxins）或杀虫结晶蛋白（）或杀虫结晶蛋白（in-secticidalin-secticidalcrysta1proteincrysta1protein，ICPICP）。）。第9页，讲稿共139张，创作于星期二作用原理：ICP通常以原毒素（protoxin）形式存在，当昆虫取食ICP后，原毒素在昆虫的消化道内被活化，转型为毒性多肽分子。活化的IC
5、P与昆虫肠道上皮细胞上的特异性结合蛋白结合，全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，细胞因渗透平衡糟破坏而破裂。导致昆虫幼虫停止进食，最终死亡。第10页，讲稿共139张，创作于星期二ICP的活化过程：首先ICP溶解在昆虫的肠道里（ICP在碱性条件可溶，而在中性条件下不溶），然后，在蛋白酶的作用下，通过专一性蛋白酶水解切割，ICP被活化。活化的ICP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破坏。第11页，讲稿共139张，创作于星期二2ICP的分类、结构及抗虫谱l据抗虫谱和序列同源性分为四种类型：类型类型I I（CryICryI）抗鳞翅目（抗鳞翅目（LepidopteraLepidoptera）昆虫，）昆
6、虫，对其幼虫有特异的毒性作用。对其幼虫有特异的毒性作用。类型类型IIII（CryIICryII）抗鳞翅目和双翅目（抗鳞翅目和双翅目（DipteraDiptera）。）。类型类型IIIIII（CryIIICryIII）抗鞘翅目（抗鞘翅目（ColeopteraColeoptera）昆虫。）昆虫。类型类型IVwIVw（CryIVCryIV）抗双翅目（）抗双翅目（DipteraDiptera）昆虫。）昆虫。第12页，讲稿共139张，创作于星期二 类 型V（CryV）抗 鳞 翅 目 和 鞘 翅 目。在每种主要类型中，据序列同源性，ICP又划分为若干亚类例如，CryI又分为IA(a)、IA(b)、IA(c
7、)、IB、IC等。第14页，讲稿共139张，创作于星期二ICP的结构Cry蛋白为长11001200个氨基酸的多肽，大小为130140kD，其毒性多肽分子是约6070kD的核心片段。活性区在氨基端，而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列没有毒性功能。第15页，讲稿共139张，创作于星期二只保留编码毒性核心片段的核苷酸序列就能达到抗虫目的。如，Bt2编码的最短毒性片段位于29至607氨基酸残基处，进一步从基因3端删除4个密码子（codon）或从5端删除8个密码子，将完全丧失产物的毒性功能。第16页，讲稿共139张，创作于星期二3.Bt基因的应用1987年比利时的Vacek等人利用农杆菌介导法首次获
8、得了转基因烟草植株。他们使用全长的CryIA（b）基因编码1155个氨基酸和该基因保留了5端编码毒蛋白核心区域的缺失片段（编码610个氨基酸）。转基因植株对烟草天蛾（ManducaSexta）幼虫的抗性为75100。第17页，讲稿共139张，创作于星期二美国Monsanto公司的Fischhoff等人（1987年）获得转Bt基因的番茄植株。他们用带有CaMV35S启动子的CryIA(b)基因转化番茄品系VF36。获得了对烟草天蛾显示出高抗虫活性的转基因植株。但因ICP表达水平低，对番茄果螟（Heliothisvirescens）的抗性不强。第18页，讲稿共139张，创作于星期二目前全世界已有许
9、多不同类型的ICP基因转入多种作物，如烟草、番茄、玉米、棉花、水稻、苹果、核桃等。第19页，讲稿共139张，创作于星期二研究结果表明：一般用全长CryIA基因转化植物，ICP在转基因植物中表达量很低，甚至检测不到，其抗虫效果差或不具抗虫性。在高抗虫性的转基因植株中，每毫克可溶性蛋白中约有2.6190ng的ICP。第20页，讲稿共139张，创作于星期二4.存在的问题及对策（1）ICP在植物中表达水平低（2）昆虫对ICP产生抗性（3）抗菌谱窄第21页，讲稿共139张，创作于星期二（1）ICP在植物中表达水平低原因：主要是mRNA不稳定和翻译效率低。天然的Bt基因富含A、T碱基,而植物基因富含G、C
10、碱基,可能导致Bt基因转录的末成熟终止（prematuretranscriptiontermination）及不适当的切割。因密码子上的差异也可能使Bt基因在植物细胞的转录过程中形成二级结构、mRNA的特定序列被降解和翻译效率降低。第22页，讲稿共139张，创作于星期二为提高富含A、T碱基的Bt基因在富含G、碱基的植物细胞中表达水平。有人对CryI基因进行了部分甚至完全的修饰。修饰后的CryI基因在转基因棉花、烟草、番茄和玉米中的表达水平有了显著提高。对策1：修饰Bt基因，改造密码子。第23页，讲稿共139张，创作于星期二Monsanto公司的Per1ak等人在不改变氨基酸序列的情况下，对Cr
11、yIA(b)和CryIA(c)基因进行修饰（主要是去除富含A、T碱基序列），使CryIA(b)和CryI(c)的表达水平提高了100倍，CryIA(b)和CryI(c)蛋白的含量提高到占可溶性蛋白的0.050.1，获得良好的抗虫效果，其中转基因棉花植株对棉铃虫（Heliothisarmingera）的抗性达80。第24页，讲稿共139张，创作于星期二对策2：使用新启动子（包括组织特异性启动子）Koziel等 人 合 成 了 一 个 富 含G,C碱 基 的CryIA(b)基因，该合成基因编码CryIA(b)的部分氨基酸，与野生型CryIA(b)基因只有65的同源性。并用适合在玉米中表达的密码子替
12、代原细菌密码子。第25页，讲稿共139张，创作于星期二利用基因枪把该基因导入玉米品种。使用3种启动子：1.CaMV35S启动子。2.玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)启动子。3.玉米花粉特异性启动子调控。后两种启动子调控下的CryIA(b)基因在转基因玉米植株中显示出明显的组织特异性。即在绿色组织中，CryIA(b)基因强烈表达，占可溶性蛋白010.4。第26页，讲稿共139张，创作于星期二对策3：寻找新一代启动子除组织特异性启动子外，研究人员也寻找第二代启动子来提高ICP基因的表达水平。例如,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子和叶绿体转运肽，可以使转基因烟草中的CryIA()表
13、达量提高10-20倍。第27页，讲稿共139张，创作于星期二（2）昆虫对ICP产生抗性对策1：使用组织专一性或化学诱导启动子。使用组织专一启动子，可使Bt基因的表达局限在植物重要的组织。第28页，讲稿共139张，创作于星期二例如，只在棉花的棉铃中表达，末经选择的害虫能在叶片上存活。病原相关蛋白（pathogen-sis-relatedprotein,即PR蛋白）是植物受到病原物侵染或其它刺激时表达的一组蛋白。PR-la是编码其中一种PR蛋白的基因,可因侵染而被诱导,也可被一些化学刺激物(包括水杨酸和聚丙酰酸)诱导。第29页，讲稿共139张，创作于星期二目前，CIBA的研究小组已经获得带PR-l
14、a启动子调控Bt基因的转基因烟草。用化学药剂处理该基因烟草，它对烟草天蛾产生抗性。因此采用上述化学诱导启动子的方法可以调控Bt基因在化学诱导剂存在下才能表达,从而降低抗性的选择压产生,以防止抗性扩散。第30页，讲稿共139张，创作于星期二对策2：修饰Bt基因,使ICP在植物中高剂量表达。迄今，目前发现的高水平的Bt抗性基因都是隐性基因,而且ICP对害虫的幼虫特别有效,所以Bt基因的连续、高剂量表达，可以消除突变杂合体。第31页，讲稿共139张，创作于星期二对策3：使用两种以上的Bt基因或Bt与其它抗虫基因结合使用。除非抗性位点出现的频率很高和毒蛋白剂量低到杂合体可以存活，否则昆虫几乎不可能对两
15、种独立杀虫蛋白同时产生耐受性。第32页，讲稿共139张，创作于星期二对策4：将转与非转基因的植株混种在繁育群体中保留一部分末经选择的害虫，防止害虫对Bt基因的抗性扩散。第33页，讲稿共139张，创作于星期二（3）抗菌谱窄对策：采用多基因导入策略，利用基因之间的协同拟菌作用，向植物体内同时导入多个基因。第34页，讲稿共139张，创作于星期二二、蛋白酶抑制剂（PI）基因及其应用1.PI基因的抗虫原理2.PI的分类及抗虫谱3.PI基因的应用第35页，讲稿共139张，创作于星期二是一类蛋白质，在植物防御昆虫和病原体侵染的天然防御系统中起着重要作用，具有明显的抗虫作用的蛋白质。PI基因的抗虫谱广泛，可抗
16、几个目的昆虫。蛋白酶抑制剂（proteinasein-hibitor,PI）：第36页，讲稿共139张，创作于星期二PI存在于自然界的所有生命体中，在大多数植物的种子和块茎中的含量可高达总蛋白的1-10。在有些果实中丝氨蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的30。第37页，讲稿共139张，创作于星期二1.PI基因的抗虫原理（1）PI与昆虫消化道内的蛋白消化酶相结合，形成酶抑制剂复合物（E），从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用，导致蛋白质不能被正常消化。第38页，讲稿共139张，创作于星期二（2）EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，使昆虫产生厌食反应。停止进食而缺乏代谢所需的一些氨基酸，导致昆
17、虫发育不正常或死亡。第39页，讲稿共139张，创作于星期二（3）蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和兔疫功能，以致昆虫不能正常发育。第40页，讲稿共139张，创作于星期二PI的作用特点：（1）PI作用于蛋白消化酶的活性中心。活性中心是酶最保守的部位，产生突变的可能性极小，故可以排除害虫通过突变产生抗性的可能性。第41页，讲稿共139张，创作于星期二（2）PI对于人、畜无害，因人、畜与昆虫的消化机理明显不同。人、畜的蛋白消化酶主要存在于肠道中，而PI在胃中的酸性条件下，被胃蛋白酶分解。第42页，讲稿共139张，创作于星期二2.PI的分类及抗虫谱植物中存
18、在三类：（1）丝氨酸蛋白酶抑制剂（2）巯基蛋白酶抑制剂（3）金属蛋白酶抑制剂第43页，讲稿共139张，创作于星期二（1）丝氨酸类蛋白酶抑制剂大多数昆虫所利用的蛋白消化酶是丝氨酸类蛋白消化酶，特别是类胰蛋白酶，因此抗虫效果明显，丝氨酸类蛋白酶抑制剂有6种，最有效的有，豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）和马铃薯蛋白酶抑制剂（patatoinhibitor，PI）第44页，讲稿共139张，创作于星期二豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）：抗虫谱广泛，抗虫效果最理想。抗鳞翅目、鞘翅目、直翅目。第45页，讲稿共139张，创作于星期二CpTI是由80个氨基酸组成的小分子多肽，分子中富含二硫键，它的一个分子具有两个抑
19、制活性中心。CpTI与胰蛋白酶紧密结合，使酶活性中心失活。第46页，讲稿共139张，创作于星期二马铃薯蛋白酶抑制剂（patatoinhibitor，PI）：有2类：PI-I家族和PI-II家族第47页，讲稿共139张，创作于星期二PI-I家族：包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂I，其成熟肽单体分子量为8.1kD，只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶第48页，讲稿共139张，创作于星期二PI-II家族：包括马铃薯和番茄蛋白酶抑制剂II，其成熟肽单体分子量为12.3kD，有两个活性中心，可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋肉酶。PI-II比PI-I抗虫效果好。对烟草天蛾等一龄幼虫抗性明显。第49页，讲稿共13
20、9张，创作于星期二（2）巯基蛋白酶抑制剂 对利用巯基蛋白酶消化植物蛋白的昆虫具有特殊抗性。对利用巯基蛋白酶消化植物蛋白的昆虫具有特殊抗性。水水稻稻巯巯基基蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂（oryzacystatinoryzacystatin）是是抗抗虫虫能能力力较较强强的的一一种种PIPI。其其基基因因序序列列内内有有两两个个内内含含子子，cDNAcDNA编编码码102102个个氨氨基基酸酸的的小小肽肽，分分子子量量约约为为1 15kD5kD，分分子子中中部部第第5252位位后后的的ln-Val-Val-Ala-Glyln-Val-Val-Ala-Gly具具有有高高度度保保守守性性,该该保保守守区区对
21、对于于维维持持抑抑制制剂剂活活力力是是必必要要的。的。第50页，讲稿共139张，创作于星期二3.蛋白酶抑制剂基因的应用1987年，英国Durham大学的Hilder等把编码CpTI的cDNA转移到烟草品种Sam-sunNN中，首先获得转CpTI基因的工程植株。第51页，讲稿共139张，创作于星期二该cDNA长550bP，由CaMV35S启动子调控。获得的烟草转基因植株能够正确表达CpTI基因，有的转基因植株中CpTI的表达量高达9.6gmg可溶性蛋白。而CpTI的表达量达到5gmg可溶性蛋白时，转基因植株就表现出明显的抗虫性。第52页，讲稿共139张，创作于星期二目前已把CpTI基因转移到许多
22、有重要经济价值的植物中，如，水稻、油菜、白薯、苹果和杨树等。第53页，讲稿共139张，创作于星期二目前已经有许多种蛋白酶抑制剂的基因或cDNA被克隆，其中有些表现出明显的抗虫作用。CpTI基因、PI-II基因和水稻巯基蛋白酶抑制剂基因是植物抗虫基因工程中应用最广、研究较深入的蛋白酶抑制剂基因。第54页，讲稿共139张，创作于星期二提高PI基因表达水平的对策：深入研究基因表达的调控机理。使用特定启动子修饰蛋白酶抑制剂基因。第55页，讲稿共139张，创作于星期二中科院遗传研究所利用不同的启动子和因子对CpIT基因进行修饰，得到不同的植物表达质粒。其中因子来自烟草花叶病毒（TMV）126kD蛋白基因
23、转录序列5未端的非转译区，由68bp组成，能够促进mRNA翻译。利用CaMV35S启动子串联因子调控的CpTI基因转化烟草，转基因烟草中CpTI的表达显著提高，但高效表达易引起转基因烟草的白化。第56页，讲稿共139张，创作于星期二三、植物凝集素基因及其应用1.基本特性2.主要种类3.抗虫原理4.基因的应用第57页，讲稿共139张，创作于星期二1.基本特性植物凝集素（lectin）是非兔疫来源的糖蛋白或结合糖的蛋白质(sugar-bindingprotein)，它们能聚集细胞和（或）沉淀糖蛋白。主要存在于细胞的蛋白粒中。第58页，讲稿共139张，创作于星期二最主要的特性是能和糖类结合。多数是一
24、些寡聚蛋白,二聚体或四聚体，少数含有两个糖结合部位的单体，如蓖麻毒蛋白。植物凝集素的蛋白质结构和基因结构有许多相似性。第59页，讲稿共139张，创作于星期二L许多植物凝集素的一级结构、凝集素与配体结合物的三维立体结构或基因结构被测定。L凝集素广泛存在于植物界，在各种组织器官中均有发现，尤以豆科植物的种子中含量最为丰富。第60页，讲稿共139张，创作于星期二2.主要种类（1）麦胚凝集素（wheatgermagg1utininwheatgermagg1utinin，GAGA）（2）雪花莲（Galanthusnivalis，GNA）凝集素（3）豌豆外源凝集素（pea-lectin,p-Lec）第61
25、页，讲稿共139张，创作于星期二麦胚凝集素：是禾本科中典型的植物凝集素，有三种WGA、WGAII和WGAIII，氨基酸组成相近。分子中甘氨酸和半胱氨酸含量很高，极性氨基酸的含量很低，不含糖。第62页，讲稿共139张，创作于星期二雪花莲：一级结构、生物合成以及基因结构已经清楚，由105个氨基酸残基组成的成熟蛋白，包括3个重复性同源片段，每个约25个氨基酸残基。对于蚜虫、叶蝉、稻褐飞虱等同翅目吸食性害虫具有极强的毒性，也能控制蚜虫一类的吸汁性害虫。第63页，讲稿共139张，创作于星期二豌豆外源凝集素：由275个氨基酸的组成的蛋白质。有活性的豌豆外源凝集素由以和两个亚基组成。能抑制豇豆象的生长。第6
26、4页，讲稿共139张，创作于星期二3.抗虫原理当被昆虫取食后，外源凝集素在昆虫的消化道中与肠道围食膜上的糖蛋白专一性结合（即不同的外源凝集素与相应的糖类结合），从而影响营养的吸收。可能在昆虫的消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖。第65页，讲稿共139张，创作于星期二4.植物凝集素基因的应用上述凝集素等的编码基因已经分离，并被成功地导入烟草和莴苣等植物中。用CaMV35S启动子或水稻蔗糖合成酶基因启动子调控，转基因烟草对蚜虫表现出明显抗性。第66页，讲稿共139张，创作于星期二Bou1ter等（1991）豌豆凝集素基因的转基因烟草植株再与转CpTI基因植株杂交，获得了既能表达豌豆凝集素又能
27、表达CpTI的双价转基因烟草，其抗虫能力显著提高。这也表明了基因间的协同作用有可大大提高作物的抗性。第67页，讲稿共139张，创作于星期二Maddock等（1990）用基因枪转化玉米胚性悬浮系，获得的表达麦胚凝集素基因的转化植株对欧洲玉米螟具有良好的抗性。存在的问题：转基因植株是否对人、畜无害，还有待证实。第68页，讲稿共139张，创作于星期二四、淀粉酶抑制剂基因及其应用1.基本特性2.抗虫原理3.应用第69页，讲稿共139张，创作于星期二1.基本特性淀粉酶抑制剂（-amylaseinhibitor，-AI）是植物界普遍存在的一类蛋白质，它能抑制哺乳动物及昆虫体内的-淀粉酶的活性，阻断对摄取食
28、物中淀粉成分的消化。-AI对植物本身和细菌的小-淀粉酶不起作用。-AI作用的最适pH值为5.6，因此对鞘翅目昆虫（消化道呈酸性的）有良好抗性。第70页，讲稿共139张，创作于星期二-AI的三种类型（小麦和大麦）：单体，12kD。对黄粉虫、米象的抑制效果明显优于二聚体。二聚体，24kD。对马铃薯甲虫、锯谷盗的抑制效果优于单体。四聚体，60kD。第71页，讲稿共139张，创作于星期二2.抗虫原理抑制昆虫消道内-淀粉酶的活性。-AI和淀粉酶结合成的EI复合物刺激昆虫过量分泌消化酶，通过神经系统反馈，产生厌食反应，最后导致非正常发育或死亡。第72页，讲稿共139张，创作于星期二3.淀粉酶抑制剂基因的应
29、用Altabella等（1990）把菜豆AI基因导入烟草，并能准确、稳定地表达。分析表明：它对黄粉虫的肠道-淀粉酶具有显著的抑制效果，同时也抑制猪胰-淀粉酶的活性。对哺乳动物的淀粉酶抑制作用大大限制了其在生食作物基因工程中的应用。第73页，讲稿共139张，创作于星期二植物抗病基因工程第74页，讲稿共139张，创作于星期二第一节抗植物病毒基因及其应用第75页，讲稿共139张，创作于星期二致病来源不同：致病来源不同：病毒（virusvirus）：生物病毒是一类个体微小，结构简单，生物病毒是一类个体微小，结构简单，只含单一核酸（只含单一核酸（DNA/RNADNA/RNA），必须在活细胞内寄生并以复）
30、，必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型微生物。制方式增殖的非细胞型微生物。真菌（FungusFungus，fungi(fungi(复）复）：一类单细胞或多细胞微一类单细胞或多细胞微生物。不含叶绿素，大都能形成硬的多糖细胞壁。属于真核生生物。不含叶绿素，大都能形成硬的多糖细胞壁。属于真核生物，包括真菌门和黏菌门等。物，包括真菌门和黏菌门等。细菌（bacteriabacteria）：为原核生物是指一大类细胞核无核膜包）：为原核生物是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区或拟核的裸露裹，只存在称作拟核区或拟核的裸露DNADNA的原始单细胞生物。的原始单细胞生物。第76页，讲稿共139张，
31、创作于星期二病毒病引起的作物病害是十分严重的，仅以马铃薯为例，病毒(PVX)引起的产量损失可10%,Y病毒（PVY）引起的损失可达80，然而迄今杂交常规育种对病毒病的防治尚无良策。基因工程技术为培育抗病毒病的新品种开辟了途径。植物抗病毒基因工程的技术路线已趋向成熟。第77页，讲稿共139张，创作于星期二第78页，讲稿共139张，创作于星期二基因工程抗病毒的技术路线：（1 1）导入病毒外壳蛋白基因。）导入病毒外壳蛋白基因。（2 2）利用病毒的卫星）利用病毒的卫星RNARNA（satelliteRNA,Sat-RNAsatelliteRNA,Sat-RNA）。）。（3 3）利用病毒非结构蛋白基因（
32、特别是复制酶）利用病毒非结构蛋白基因（特别是复制酶-replicasereplicase基因）。基因）。（4 4）缺损干扰颗粒（人工构建）缺损干扰颗粒（人工构建）（defectiveinterferingparticledefectiveinterferingparticle）（5 5）干扰素（）干扰素（interferoninterferon）基因）基因（6 6）利用反义）利用反义RNARNA技术技术（7 7）利用中和抗体法技术）利用中和抗体法技术（8 8）设计核酶剪切病毒）设计核酶剪切病毒RNARNA第79页，讲稿共139张，创作于星期二第一节抗植物病毒基因及其应用一、外源病毒外壳蛋白（c
33、oatproteincoatprotein，C C）基因二、病毒复制酶基因三、卫星RNA四、核糖体失活蛋白基因五、干扰素基因六、缺陷干扰颖粒第80页，讲稿共139张，创作于星期二一、外源病毒外壳蛋白（C）基因1.CP基因的抗病毒原理2.2.转基因植株的特点3.3CP基因的应用4.4.存在的问题第81页，讲稿共139张，创作于星期二1.CP基因的抗病毒原理当入侵病毒的裸露核酸进入植物细胞后，立即被细胞中的自由CP包裹，阻止了入侵病毒核酸的翻译和复制。在水平上抑制病毒脱壳。第82页，讲稿共139张，创作于星期二导入的CP基因都是缺失的不完整的，该类基因主要是缺少AUG密码子，当这种不能被翻译的CP
34、基因或CP基因的反义RNA基因整合到植物染色体上后，能使转基因植株获得很好的抗性说明这类转基因植株的抗性机理不是外壳蛋白在起作用，而可能是它们的RNA转录体与入侵病毒RNA之间相互作用。第83页，讲稿共139张，创作于星期二许多种类病毒组及病毒的基因具有同源结构，在一定的条件下，一种基因将可能抗多种病毒。第84页，讲稿共139张，创作于星期二2.转基因植株的特点抗性与表达量成正相关。在一定程度上延缓或减轻发病，不影响生长发育、孕性表现和生理表现。抗性可稳定地遗传给子代。抗性水平与整合到植物细胞中的CP基因拷贝数有关，多拷贝的比单拷贝的抗性高。第85页，讲稿共139张，创作于星期二3CP基因的应
35、用目前已被克隆的CP基因：TMV、马铃薯病毒（potatovirusX，PVX）、黄瓜花叶病毒(cucumbermosaicvirus,CMV)、PVY、水稻条纹叶枯病毒（ricestripevirusvirus,RSV）、TSWV、PLRV、TRV、苜蓿花叶病毒（alfafamosaicvirus,ALMV）、洋李痘病毒（plumpoxvirus,PRV）等。第86页，讲稿共139张，创作于星期二Monsanto公司在1988年获得了表达TMV的CP基因的番茄品种VF36的转基因植株。在接种后表现出延迟发病，发病率小于5%，产量几乎不受影响，而对照植株则100%发病，果实减产26-35%。第
36、87页，讲稿共139张，创作于星期二Monsanto公司1990年把PVX和PVY的CP基因同时导入北美最重要的马铃薯品种ussetBurbank，其中筛选出的一个转基因株系在接种条件下，完全抗PVX和PVY，而田间试验表明,传毒蚜虫接种16周后,转基因植株只有8%的发病率,而对照植株的发病率却高达79.3%。第88页，讲稿共139张，创作于星期二荷兰Wageningen农业大学把TSWV的CP基因导入烟草SR1,试验室接种实验表明,转化植株获得了90%的保护效果,而对照株在接种后6天全部发病。第89页，讲稿共139张，创作于星期二1991年日本国家农业环境所获得了水稻品种Kinuhikari
37、Nipponbai的转RSV的CP基因的抗纹叶枯病病毒的工程植株，接虫实验表明，转基因植株在2-3周后,只有3%-5%的发病率,而对照植株的发病率为95%-100%。这是禾本科作物中用基因工程获得抗病毒特性的第一例成功报道。第90页，讲稿共139张，创作于星期二奥地利的农林大学的科研人员把欧洲和整个地中海地区的核果实树的最重要的病毒PVR的基因导入杏。第91页，讲稿共139张，创作于星期二在国内，中科院微生物所等单位获得了烟草NC89的双抗株系（抗MTVCMV）和单抗株系（抗TMV）。纯合系的大田试验表明，转基因植株的抗病毒效果达70。已获得转CP基因植株：烟草、马铃薯、水稻、番茄、欧洲李和杏
38、等。第92页，讲稿共139张，创作于星期二4.存在的问题转基因植株对病毒的抗性水平不高，且仅限于特定的病毒或密切相关的病毒。转基因植株大多只是推迟发病，而不能彻底根治。异源包被：转转基基因因表表达达的的一一种种病病毒毒外外鞘鞘蛋蛋白白可可能能包包被被另一种相近的有害病毒基因，形成一种新的杂合体。另一种相近的有害病毒基因，形成一种新的杂合体。第93页，讲稿共139张，创作于星期二二、病毒复制酶基因1.抗病毒原理2.应用3.特点第94页，讲稿共139张，创作于星期二病毒复制酶基因：是病毒非结构蛋白基因。复制酶一般是在病毒核酸进入寄主细胞并结合到寄主核糖体之后形成。第95页，讲稿共139张，创作于星
39、期二1.抗病毒机理RNA转录体干扰病毒的复制。病毒非结构蛋白基因介导抗性。复制酶基因抑制病毒复制必须具备2个条件：1.具有一定空间构象。2.不完整性。第96页，讲稿共139张，创作于星期二携有编码54kD蛋白基因的转基因烟草中检测不到54kD的蛋白产物，这说明很可能是其RNA转录体干扰了病毒的复制TMV的编码126kD的完整基因导入植株后，植株却未获得抗性；而若插入1.4kD的核酸序列，使其基因失去功能，则能赋予植物抗性。第97页，讲稿共139张，创作于星期二把的A编码126kD蛋白的通读部分(readthrough)的54kD（包含病毒复制酶核心功能团）的基因导入烟草，转基因烟草对TMV表现
40、出很高的抗性(接毒500g/ml,植株不发病)。很可能是不完整的复制酶亚基基因赋予了植物细胞这种抗性。第98页，讲稿共139张，创作于星期二2.病毒复制酶基因特点病毒复制酶基因所介导的抗性强。远远强于基因介导的抗性。即使对转基因植株使用高浓度的病毒或其RNA，仍具有明显抗性。第99页，讲稿共139张，创作于星期二3.病毒复制酶基因的应用用豌豆早褐病毒（PEBV）221kD的复制酶中相当于TMV的54kD部分的核酸片段转化烟草，获得的转基因植株对高达1000g/ml的接种量仍具有高度抗性。第100页，讲稿共139张，创作于星期二将编码CMV复制酶的二个亚基的缺失的cDNA转入烟草，工程植株可抗5
41、00g/ml的病毒或100g/mlRNA的接种量。第101页，讲稿共139张，创作于星期二三、卫星RNA1.抗病毒原理2.应用3.存在问题第102页，讲稿共139张，创作于星期二卫星RNA：卫卫星星RNARNA是是多多核核苷苷酸酸，它它们们有有时时在在其其相相伴伴病病毒毒中中被被发发现现。它它们们按按照照相相伴伴病病毒毒的的复复制制和和传传播播机机制制，从从一一个个植植株株传传到到别别一一个个植植株株。它它们们不不与与其其相相伴伴病病毒毒的的核核苷苷酸酸序序列列同同源源，对对病病毒毒的的复复制制也也不不起起作作用用。但但是是卫卫星星RNARNA具有改变其相伴病毒的致病力的能力。具有改变其相伴病
42、毒的致病力的能力。第103页，讲稿共139张，创作于星期二1.抗病毒原理相应病毒侵入植物细胞，其卫星RNA被激活和放大，对病毒产生抗性。抗性水平不因病毒的接种量而降低。植物细胞中只要有低浓度的卫星RNA的转录体即可产生抗性。第104页，讲稿共139张，创作于星期二2.病毒卫星RNA的应用目前获得一些带有病毒卫星RNA的转基因植株。如，表达CMV和烟草环斑病毒（TRV）的卫星序列的转基因烟草植株。当被其相应的病毒侵染时，其发病症状减轻。第105页，讲稿共139张，创作于星期二3.存在问题只有少数植物病毒含有卫星RNA，限制了应用范围。卫星RNA有可能被其自然的病毒载体包装并释放到环境中。一个核甘
43、酸的突变可能会造成严重病状，或病毒卫星RNA和植物卫星RNA重组，从而产生一种难以预料的病症。有些卫星RNA能够增强病毒的致病力。第106页，讲稿共139张，创作于星期二四、核糖体失活蛋白基因1.RIP分类2.RIP作用机理3.RIP基因的应用第107页，讲稿共139张，创作于星期二是一类能抑制蛋白质生物合成的蛋白，广泛存在于高等植物中，含量丰富。核糖体失活蛋白：（ribosome-inactivatingprotein，RIP）第108页，讲稿共139张，创作于星期二.RIP分类据结构可为据结构可为2 2种类型：种类型：I I型型RIPRIP：是是单单链链碱碱性性蛋蛋白白质质。分分子子量量约
44、约为为30kD30kD，带带有有或或不不带带有有糖糖基基，但但其其生生物物活活性性都都一一样样，都都具具有有抑抑制制无无细细胞胞蛋蛋白白质质生物合成的作用生物合成的作用,对完整细胞或动物呈无毒或低毒。对完整细胞或动物呈无毒或低毒。II II型型RIPRIP：是由是由A A、B B两条肽链通过二硫键组成的二聚体。两条肽链通过二硫键组成的二聚体。分分子子量量约约为为60kD60kD。其其A A链链与与I I型型RIPRIP同同源源呈呈酸酸性性或或碱碱性性，是是毒毒性性分分子子，B B链链是是凝凝集集素素，能能结结合合到到细细胞胞膜膜表表面面并并协协助助A A链进入细胞。链进入细胞。第109页，讲稿
45、共139张，创作于星期二.RIP作用机理RIP选择性作用于60S核糖体大亚基，抑制肽链延伸。大多数植物和细菌中的RIP是通过它的N一糖苷酶（N-g1ycosidase）活性来抑制蛋白质合成的功能。它特异地作用于28rRNA的第4324位核苷酸的腺瞟呤与核糖之间的N一糖苷键，进行水解，除掉腺瞟呤，使核糖体失活，不能合成蛋白质。第110页，讲稿共139张，创作于星期二真菌中的RIP则通过其核酸酶（RNase）活性起作用，RIP专一水解真核细胞核糖体28rRNA第4325和4326位核苷酸之间的磷酸二酯键。不同的RIP分别对于病毒、真菌和昆虫具有不同的抗性。能使植物获得广谱抗性。第111页，讲稿共1
46、39张，创作于星期二商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein，PAP)抗植物和动物的多种不同病毒。现已分别从商陆的春叶、夏叶和种子中分离出三种PAP，分子量分别为29kD、30Kd、31kD。均不含糖的单链RIP。PAP抑制病毒，使病毒不能制造自身的蛋白，同时也不能利用寄主细胞的蛋白。第112页，讲稿共139张，创作于星期二.RIP基因的应用Monsanto公司克隆了编码PAP的基因。通过农杆菌介导，把该基固导入烟草和马铃薯细胞，并获得了转基因植株。含高浓度的PAP（0ngmg蛋白）的转基因烟草植株生长发育缓慢，患叶斑病，而且败育。含较低浓度的PAP（15ngmg蛋白）
47、的植株生长正常。第113页，讲稿共139张，创作于星期二五、干扰素基因1.抗病毒原理2.干扰素基因的应用第114页，讲稿共139张，创作于星期二1.抗病毒原理 干干扰扰素素是是一一类类分分子子量量小小的的蛋蛋白白质质，能能结结合合在在细细胞胞质质膜膜上上，并导致抗病毒态的形成。并导致抗病毒态的形成。干干扰扰素素促促进进寡寡核核苷苷酸酸合合成成酶酶、核核酸酸内内切切酶酶和和激激酶酶的的产产生生，导导致致抗抗病病毒毒态态。三三种种酶酶平平时时处处于于静静止止状状态态，当当细细胞胞被被病病毒毒感感染染后后才才活活化化，活活化化后后通通过过两两种种不不同同途途径径来来阻阻断断蛋蛋白白质质的的合合成成。
48、一一是是活活化化后后的的激激酶酶将将蛋蛋白白质质合合成成过过程程中中所所需需的的起起始始因因子子磷磷酸酸化化，使使其其丧丧失失活活性性。二二是是由由寡寡聚聚腺腺苷苷酸酸激激活活一一种种核核酸酸内内切切酶酶，降降解解mRNAmRNA。干扰素作用特别强，且赋予细胞对病毒的广谱抗性。干扰素作用特别强，且赋予细胞对病毒的广谱抗性。第115页，讲稿共139张，创作于星期二2.干扰素基因的应用爱沙尼亚科学院、芬兰农业研究中心及赫尔辛基大学的研究人员共同合作，把大鼠中编码干扰素之一的2，5寡腺苷酸合成酶的基因导入马铃薯，获得转基因植株，用PVX进行浸染，叶和块茎里的病毒浓度显著低于未转化的对照。效果好于基因
49、的效果。第116页，讲稿共139张，创作于星期二六、缺陷干扰颗粒及其利用缺陷干扰颗粒（defectiveinterferingdefectiveinterfering，DIDI）：）：是指序列与亲本病毒相关、但必须依赖于病毒才能复制的RNA分子。第117页，讲稿共139张，创作于星期二 在在自自然然界界中中，这这种种分分子子存存在在于于多多种种动动物物病病毒毒和和植植物物病病毒毒中。中。与与卫卫星星RNARNA的的区区别别：DIDI颗颗粒粒和和病病毒毒核核酸酸同同源源，DIDI颗粒直接来源于病毒的核酸序列。颗粒直接来源于病毒的核酸序列。与与反反义义RNARNA的的区区别别：DIDI颗颗粒粒是是
50、利利用用有有义义RNARNA去去竞竞争争病毒复制酶的结合位点，从而干扰病毒复制。病毒复制酶的结合位点，从而干扰病毒复制。第118页，讲稿共139张，创作于星期二 MarshMarsh等等发发现现用用大大麦麦花花叶叶病病毒毒（barelybarelymosaicmosaic virusvirus，BMVBMV）的的RNA2RNA2构构建建的的D D颗颗粒粒在在大大麦麦原原生生质质体体内内对对病病毒毒的的复复制制有有干干扰扰。而而Stan1eyStan1ey等等人人则则从从非非洲洲木木薯薯花花叶叶病病毒毒（ACMVACMV）中中克克隆隆了了缺缺陷陷干干扰扰颗颗粒粒DNABDNAB。经经串串联联重重