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1、关于植物基因工程第1页，讲稿共117张，创作于星期二转基因植物(Transgeneplant)是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但现在该名词更多的特指那些在实验室更多的特指那些在实验室里通过重组里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。造出拥有新特性的植物。第2页，讲稿共117张，创作于星期二第一节 植物基因的克隆与分离第二节 植物基因工程研究常用的基因第三节 植物基因转移的病毒载体第四节植物基因转移的质粒载体第五节植物基因转化方法第六节转基因植物的检测鉴定第3页，讲稿共117张，创作于星期二第一节 植物
2、基因的克隆与分离一、根据基因的功能分离目的基因但在任何类型的细胞中，都仅有少数的基因表达成相应的蛋白质，而且其表达活性和种类还会随着发育阶段及环境因素的变化而变化。因而单从蛋白质水平出发分离目的基因，显然是存在着相当的难度和一定的局限性。一种比较有效的分离高等植物基因的策略，它涉及目的基因编码产物蛋白质的分离、纯化及突变体表型的互补克隆。在纯化相应的编码蛋白后，构建cDNA文库或基因组文库，DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行：(1)(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，合成寡核苷酸探针从将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，合成寡核苷酸探针从cDNAcDNA库或基库或基因组文库中筛选编码
3、基因；因组文库中筛选编码基因；(2)(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNAcDNA入载体表达库中筛选相应入载体表达库中筛选相应克隆。克隆。从蛋白到从蛋白到DNADNA第4页，讲稿共117张，创作于星期二二、根据mRNA特异分离目的基因mRNA差别显示技术、cDNAcDNA代表性差示分析（代表性差示分析（RDARDA）2.mRNA2.mRNA差别显示的技术差别显示的技术 1993年，由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所工作的两位科学家P.Liang和A.D.Pardee建立。1.1.mRNAmRNA差减杂交差减杂交(subtractive
4、hybridization)(subtractive hybridization)技术，又叫差减技术，又叫差减cDNAcDNA克克隆隆 根据不同材料mRNA种类的差别分离目的基因。只适用于缺失突变体，在很大程度上受生物体核DNA复杂性的影响，而且又存在着实验周期长、重复性差、效率低等缺点。1992年，美国哈佛大学的F.M.Ausubel实验室，应用该法从拟南芥菜中克隆到了一个与植物茎杆高度相关的基因，这可能是已见报道的为数不多的典型例子之一。第5页，讲稿共117张，创作于星期二3.cDNA代表性差示分析代表性差示分析(representational difference analysis)技
5、术，技术，cDNA RDA1994年M.Huband和D.G.Scatz在N.Lisitsyn等人的基础上，发展了一种用于克隆差别表达的基因的方法。此法保留了差减杂交和差别显示的精髓，并充分发挥了PCR反应以指数形式扩增双键模板而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段。现已被广泛地应用于分离编码产与未知的发育基因。第6页，讲稿共117张，创作于星期二第7页，讲稿共117张，创作于星期二Neurospheres(NS)areculturedbytheusualmethods.Sisterculturesarediff
6、erentiatedfor24hoursandeacharesubjectedtorepresentationaldifferenceanalysis(RDA)withtworoundsofsubtraction.Thesubtractedproductsarethenclonedintoplasmids,propagatedinbacteria,andarrayedathighdensityontoaglassslide.ThecustommicroarrayisthenscreenedwithamplifiedcomplementaryDNAderivedfromadifferentset
7、ofneurosphereanddifferentiatingcell(DC)cultures.Thegenesthatareverifiedtobeenrichedinneurosphereculturesarethensubjectedtosequenceanalysisandfurtherscreeningbyin situhybridization.Cy3andCy5aregreenandredfluorescentdyes,respectively.bFGF,basicfibroblastgrowthfactor;E17,embryonicday17;P0,dayofbirth;P1
8、ctx,postnatalday1cortex.第8页，讲稿共117张，创作于星期二三、根据DNA的插入作用分离目的基因 当一段特定的DNA序列，插入到植物基因组中目的基因的内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体植株。如果此段DNA插人序列是已知的，那么它便可用来作为DNA杂交的分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因。而后再利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。由于插入的DNA序列相当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNADNA标签法标签法(DN
9、A-tagging)(DNA-tagging)。DNA标签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方法，T-DNA（T-DNA taggingT-DNA tagging）和转座子（transposon taggingtransposon tagging）均可作为基因标签。第9页，讲稿共117张，创作于星期二 转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。异源转位子标签法异源转位子标签法(hetrologous transposon taggi
10、ng)(hetrologous transposon tagging)利用已经在分子水平上研究得比较清楚的外源转位子，分离异源基因的技术 同源转位子标签法同源转位子标签法(homologous transposon tagging)(homologous transposon tagging)：用内源转位子分离同源寄主基因的技术1.转座子标签法（Transposontagging）第10页，讲稿共117张，创作于星期二第11页，讲稿共117张，创作于星期二第12页，讲稿共117张，创作于星期二（1）采取农杆菌介导等适当的转化方法把转座子导入目标生物体；（2）转座子在目标生物体内的初步定位；（3
11、）转座子插入突变的鉴定及分离；（4）转座子在目标生物体内的活动性能检测；（5）对转座子插入引起的突变体，利用转座子序列作探针，分离克隆目的基因。转座子标签法的主要步骤：转座子标签法的主要步骤：(2)其次，转位子转位插入突变的频率比较低，而且在植物基因组中还常常存在着过多拷贝的转位子序列。因此，应用转位子标签法分离植物基因，不仅实验周期长，工作量大，同时还需花费大量的人力和财力。转位子标签法的局限性：转位子标签法的局限性：(1)首先，转位子标签法只适用于存在着内源活性转位子的植物种类。而在自然界中这样的植物并不多。(3)再者，如果转位子的转位插入作用引起了致死突变，或是对于由多基因控制的某种性状
12、，转位插入造成的单基因突变就不足以使植株产生出明显的表型变异，就难以分离到我们所期望的目的基因的。第13页，讲稿共117张，创作于星期二Transposon tagging,expression and sequence of the ra1 genea,DNAgelblotshowingco-segregationofra1-m2andSpm.Lanes15,Spmprobe;lanes610,sameblotprobedwithDNAflankingtheSpmtransposonthatco-segregatedwithra1-m2.Phenotypesandgenotypesoflan
13、es:1and6,normalhomozygousprogenitorra1+;lanes2and7,mutanthomozygousra1-R;lanes3,4,8and9,somaticmosaicofmutantandnormalheterozygousra1-R/ra1-m2;lanes5and10,normal,heterozygousra1-R/ra1-m2rev4(astable,normalallelederivedfromra1-m2).The5.5-kbfragment(arrowheads)containsbothSpmandra1.The7.8-kbprogenitor
14、ra1+fragmentisrestoredbySpmexcision,eitherinvariablestoichiometrieswhenexcisionoccurssomatically(lanes8and9)orentirelywhenitoccursgerminally(lane10).The14-kbfragment(lanes710)derivesfromra1-R.b,RNAgelblot.Lane1,vegetativeshootapices;lanes26,equallystagedimmaturetassels.c,Singleletteramino-acidcodetr
15、anslationofthera1openreadingframe.Solidlineindicatesthezinc-finger,dottedlinehighlightstheEARdomain.Changesinmutantallelesareshownabovethesequence,adjacenttothealleledesignation:insertionlocationsindicatedbycarets;ra1-RSalternativemethioninecodonindicatedwithanarrow;aminoacidchangesshown.d,Multiplea
16、minoacidsequencealignmentofthezinc-fingerandEARdomainsofRA1frommaize(RA1maize),sorghum(S_bicolor_2)andMiscanthus(M_sinensis),andofEPFsfrommaize,rice(AAAA.)andArabidopsis(gi.).Absolutelyconservedresidueshighlightedinred,highlyconservedresiduesinyellow.第14页，讲稿共117张，创作于星期二 转座子标签法不但可以通过上述转座突变分离基因，转座子标签法
17、不但可以通过上述转座突变分离基因，而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植而且当转座子作为外源基因通过农杆菌介导等方法导入植物时，还会由于物时，还会由于T-DNAT-DNA（transferred DNA）整合到染色整合到染色体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分体中引起插入突变，并进而分离基因，因此大大提高了分离基因的效率。离基因的效率。第15页，讲稿共117张，创作于星期二SystemsforinsertionalmutagenesisinArabidopsis萘乙酰胺(Naphthalene acetamide,NAM)IAAH：吲哚乙酰胺水解酶基因(对萘乙酰胺NA
18、M 敏感)；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因(对卡那霉素敏感)第16页，讲稿共117张，创作于星期二2.T-DNA标签法花椰菜花叶病毒(CaMV)35S多聚增强子 在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefactyns)中，存在着一种决定植物产生冠瘿病的Ti质粒。这种质粒的T-DNA能够发生高频的转移。当根瘤土壤杆菌感染了寄主植物细胞之后，T-DNA通过其两端的25bp的同向重复序列，完全整合到植物的核基因组上。根据目前的实验结果，一般认为T-DNA在植物核基因组中的插入位置是随机的。在T-DNA标签法中，可通过在T-DNA序列中插入一个报告基因或是一个增强子，以有利于对转化的原生
19、质体或是培养的细胞进行筛选。T-DNA第17页，讲稿共117张，创作于星期二Reverse genetics:Top,gene structure of FASCIATA 1 with exons in blue and introns in yellow.Red denotes a bacterial T-DNA that has inserted into the gene.Bottom,mutants lacking the wild-type FAS1 gene have altered development.第18页，讲稿共117张，创作于星期二第19页，讲稿共117张，创作于星期
20、二第二节 植物基因工程研究常用的基因一、选择标记（selectable marker genes）标记基因与标记基因与选择标记选择标记?如何选择和筛选转化体同样是一个重要问题。克隆的外源目的基因，对于植物受体细胞的转化频率往往是相当低的。在数量庞大的受体细胞群体中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源的DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞，则更加稀少。为了有效地选择出这些真正的转化子，就有必要使用特异性的选择标记基因(标记基因)。科学家一直试图把转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。至今己建立了许多标记基因，并已插入各种转化载体中，作为一种标记基因。第20页，讲稿共1
21、17张，创作于星期二植物细胞转化实验中，应选择何种选择标记基因：1)其代谢产物不干扰寄主细胞的正常的新陈代谢活动；2)为转化细胞提供抵抗选择剂抑制作用的能力；3)选择培养基中所用的抗代谢物对转化细胞再生植株的生长，不应有明显的影响。主要是一类编码可使抗菌素(诸如新霉素、潮霉素、链霉素以及庆大霉素等)或除草剂失活的蛋白酶的基因。第21页，讲稿共117张，创作于星期二标记基因抗菌素抗性基因新霉素(neomycin)磷酸转移酶基因潮霉素(hygromycin)磷酸转移酶基因链霉素(streptomycin)磷酸转移酶基因庆大霉素(gentamycin)乙酰转移酶基因抗除草剂抗性基因膦丝菌素(phos
22、phinothricin)乙酰转移酶基因，即bar基因5-烯醇丙酮酰草莽酸合成酶基因，即EPSP合成酶基因植物基因工程研究常用的标记基因1.1.新霉素磷酸转移酶基因新霉素磷酸转移酶基因2.Bar2.Bar基因基因例：例：第22页，讲稿共117张，创作于星期二卡那霉素是由卡那霉素链霉菌(Streptomyceshanamyceticu)产生的一种氨基糖苷类抗菌素，新霉素是弗氏链霉菌(Streptompcefradiae)产生的另一种氨基糖苷类抗菌素。这种抗菌素抗菌作用的机理是，通过与30S核糖体亚基的结合作用，而抑制蛋白质的合成。将neo基因转移到真核细胞中表达，同样能够使卡那霉素、新霉素以及G
23、418失活。因此，获得了neo基因的转基因寄主植物细胞便具备了抵抗这些抗菌素作用的能力。该基因已被广泛地用作植物细胞转化的选择标记基因。不过有许多单子叶植物培养细胞，天然具有抵抗高水平卡那霉素的能力，因此在选用neo作选择标记基因时，这一点是要认真汲取的。1.新霉素磷酸转移酶基因（新霉素磷酸转移酶基因（NeomycinPhosphotransferase,NPT-）第23页，讲稿共117张，创作于星期二卡那霉素抗性(Kanr)基因即新霉素磷酸转移酶基因(NPT)，亦可称为氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph 2)，它来自大肠杆菌(E.coli)的aphA2基因。是目前在植物基因转化中应用最广泛的选择
24、标记基因。它编码的产物氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3)酶)能对氨基糖苷类抗生素卡那霉素具有抗性。此酶最早是从细菌转座子Tn5 中分离得到的，它的作用原理是：NPT 基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生素失效，从而解除毒性。因为卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞的死亡。而转基因植物由于含有卡那霉素抗性(NPT)基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素，转化体就很容易从非转化体中筛选出来。第24页，讲稿共117张，创作于星期二 从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中克隆的bar基因，是一种十分有用的、
25、尤其是对于禾谷类粮食作物特别有效的选择标记基因。它编码的膦丝菌素乙酸转移酶，通过乙酸化作用会使膦丝菌素失去毒性。表达bar基因的植物转化细胞，在经受致死剂量的膦丝菌素处理之后，仍能正常生长或是以接近正常的速率生长，而敏感的非转化植株则迅速停止生长，并在1021天内死亡。这个选择标记基因，已成功地应用于水稻、玉米、小麦、高粱以及大麦、燕麦、黑麦等多种禾谷类粮食作物的转基因研究。当然，在使用除草剂抗性基因bar作为选择标记基因时。要特别小心，以避免产生抗除草剂的转基因杂草。2.Bar2.Bar基因基因第25页，讲稿共117张，创作于星期二A:Transgenicrice(BarGene)B:Non
26、e-transgenicRiceTransgenic herbicide-resistant（抗除草剂）（抗除草剂）rice第26页，讲稿共117张，创作于星期二TheseDNAcassetteswereinsertedintoplasmidpJR1withthebargeneunderthecontrolofthe35Spromoterforselectionoftransformantsonbialophos.EiStua1andEiRtua1,sensitiveandresistant-tubulingenes;Zmtub1,-tubullingene;nos,nopalinesynth
27、asegene;term,terminus.第27页，讲稿共117张，创作于星期二二、报告基因（reporter gene）1.概念：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。一种理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且还应具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。2.报告基因的应用：启动子的检测、启动子的检测、反式
28、作用因子的检测、反式作用因子的检测、相关蛋白质的分离、基因工程细胞系的构建。相关蛋白质的分离、基因工程细胞系的构建。第28页，讲稿共117张，创作于星期二3.3.常用的报告基因常用的报告基因 报告基因实质上起到了判断目的基因是否表达的标记基因的作用，故报告基因有时也可叫做选择标记基因(selectable marker gene)。目前研究工作者已经从大量的基因中挑选出了若干种有用的报告基因。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(npt)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基
29、因、荧光酶基因等。第29页，讲稿共117张，创作于星期二nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。npt、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。第30页，讲
30、稿共117张，创作于星期二目前常用的一种报告基因是-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。例：例：GUS(GUS(-glucuronidase)-glucuronidase)、大肠杆菌大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶、葡萄糖醛酸糖苷酶、萤光素酶基因、萤光素酶基因、GFPGFP第31页，讲稿共117张，创作于星期二-葡萄糖
31、醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶(-glucurondase，GUS)大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶(-glucurondase，GUS)，具有良好的稳定性，灵敏度高，易于检测。作用的底物是无色的X-葡萄糖苷酸(X-glucuronide简称Xgluc，是Xgal的类似物)。当把表达-葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物细胞，同5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoly-D-glucuronide)一道温育时，GUS酶就会把反应体系中的此种无色的底物水解产生出深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝。GUS酶的此种显色水解作用，依所用的X-gluc底物的不同而有所差别。第32
32、页，讲稿共117张，创作于星期二大肠杆菌大肠杆菌-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶-(glucuronidase)GUS-(glucuronidase)GUS 转基因烟草的幼苗，在CaMV-35S 启动子作用下表达GUS(beta-glucuronidase)，不同的底物颜色不同：转基因烟草第33页，讲稿共117张，创作于星期二promotertrapvectorwithpromoterlessgusgene第34页，讲稿共117张，创作于星期二pCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBam HIHindIIIKpnIBa
33、m HIKpnIHyg(R)T7PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3pCAM-RSP1/2-GuspCAM-RSP1/2-GusHyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用用KpnI和和BamHI双酶切后连接双酶切后连接BamHINos3Nos3LBRB(1715 bp)First intron(1182 bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因启动子驱动水稻蔗糖合酶基因启动子驱动GusGus基因的表达基因的表达载体构建载体构建第35页，讲稿共117张，创作于星期二萤光素酶基因萤光素酶基因使用-葡萄糖醛酸糖苷酶的编码基因gusA作报告基因有一个明显的缺点，即组织化学检测法
34、会使细胞致死。若是改用萤光素酶的编码基因(luc)则可避免细胞致死，而且表达目的基因的活细胞的分布状况还可根据萤光的产生被测定出来。因此，被广泛地用作植物基因工程研究的报告基因。最常用的是来自萤火虫(Photinuspyralis)的萤光素酶(luciferase)。这是一种分子量为60.7kD的单体蛋白质多肽，共有550个氨基酸，它的编码基因luc已经被克隆。第36页，讲稿共117张，创作于星期二Luc Reporter Gene SystemPhotinuspyralis萤光素酶基因萤光素酶基因（luciferaseluciferase）第37页，讲稿共117张，创作于星期二第38页，讲稿
35、共117张，创作于星期二第39页，讲稿共117张，创作于星期二promotertrapvectorwithpromoterlessfireflyluciferasegene第40页，讲稿共117张，创作于星期二GFP(GreenFluorescentProtein)绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。第41页，讲稿共117张，创作于星期二被烟草花叶病毒感染的烟草，通过GFP可观测病毒的侵染。检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强
36、烈检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。统进行绿色荧光蛋白检测和定位。第42页，讲稿共117张，创作于星期二报告基因-葡萄糖醛酸糖苷酶(-glucuronidase)基因荧光素酶(luciferase)基因氯霉素乙酰转移酶(chioramphenicolacetyltransferase)基因-半乳糖苷酶(-galactosidase)基因胭脂碱合成酶(nopalinesynthetase,nos)基因章鱼碱合成酶(octop
37、inesynthetase,ocs)基因乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthetase)基因苏氨酸脱水酶(threoninedehydratase)基因绿色荧光蛋白质(greenfluorescentprotein)基因植物基因工程研究常用的报告基因第43页，讲稿共117张，创作于星期二三、抗虫基因三、抗虫基因1.1.微生物源的抗虫基因；微生物源的抗虫基因；2.2.植物源的抗虫基因；植物源的抗虫基因；3.3.动物源的抗虫基因。动物源的抗虫基因。虫害是造成农作物减产的最重要的自然灾害之一，全世界每年粮食总产量因病虫害而减产的幅度约为37，其中仅虫害一项就占13，经济损失达数千亿美元
38、(转引自L.Jouanin，1998)。目前农作物的虫害防治，仍然是主要依靠化学农药(agrochemicals)的使用。但它同时也存在着诸多方面的弊端，直接地影响到农业生产的进一步发展。植物基因工程的建立，特别是转基因技术的应用，为农业害虫的防治提供了一条全新的途径。第44页，讲稿共117张，创作于星期二微生物源的抗虫基因微生物源的抗虫基因crycry基因基因：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)最早于1902年在日本国发现，1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidal crys
39、talline inclusions)，其中的晶体蛋白质(crystalline protein，Cry)是由叫做-内毒素(endotoxins)的原毒素亚基(protoxin subunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌株都会产生一系列的-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，故这种蛋白质又叫做杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)，或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bt toxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或-外毒素(-exotoxin)，同样也具有抑制幼虫生长的能力。第45页，讲稿共117张，创作于
40、星期二Cry基因转双抗虫基因741杨 优良白杨杂种741杨表达载体上构建了两种不同杀虫机制的Bt CryIAc基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因（API）。并获得了一批对多种鳞翅目害虫具有高抗虫性的株系。国内第一批应用于商品化生产的转基因树木品种。第46页，讲稿共117张，创作于星期二植物源的抗虫基因植物源的抗虫基因1）蛋白酶抑制剂基因：在昆虫的体内存在着一些特殊的蛋白酶；常见的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等丝氨酸类蛋白酶。这些蛋白酶是昆虫生理代谢过程中的必要成分，负责裂解和消化食物中的蛋白质。一旦昆虫体内的这些蛋白酶的活性受到抑制，就将无法消化食物中的蛋白质成分，致使饥饿而死亡。有一些植物在长期的进化过
41、程中，产生出了一种用以抵抗害虫侵染的天然的免疫体系，在这类植物细胞中含有相当丰富的蛋白酶抑制剂(proteinaes inhibitor，PI)，它可使昆虫体内相应的蛋白酶丧失活性。植物的蛋白酶抑制剂，是一类小分子量的蛋白质(525kD)，共有10个家族。根据它们作用的靶酶，又可分成四种不同的类型：丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酰蛋白酶抑制剂(aspartyl protease inhibitor)。若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫特性。第47页，讲稿共117张，创作于星期二植物蛋白酶抑制剂家族及类型（1 1）S=S=丝氨酸蛋白质酶抑制剂；丝
42、氨酸蛋白质酶抑制剂；M=M=金属蛋白酶抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；C=C=半胱氨酸蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；A=A=天冬氨酸蛋白质抑制剂。天冬氨酸蛋白质抑制剂。（2 2）Bowman-BirkBowman-Birk系指发现这种蛋白酶抑制剂的两位科学家的姓氏。系指发现这种蛋白酶抑制剂的两位科学家的姓氏。序 号家 族类 型（1）1大豆胰蛋白酶抑制剂家族(Soybean trypsin inhibitor family)S2Bowman-Birk抑制剂家族(Bowman-Birk inhibitor family)S3大麦蛋白酶抑制剂家族Barley trypsin inhibitor fa
43、mily)S4马铃薯抑制剂家族(Potato inhibitor family)S5马铃薯抑制剂家族(Potato inhibitor family)S6南瓜抑制剂家族(Squash inhibitor family)S7Ragi1-2/玉米双功能抑制剂家族Ragi 1-2/maize bifunctional inhibitor family)S8羧肽酶A、B抑制剂家族(Carboxypeptidase A,B inhibitor family)M9半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(Cysteine protease inhibitor family)C10天冬氨酸蛋白酶抑制剂家族(Aspartyl
44、 protease inhibitor family)A第48页，讲稿共117张，创作于星期二若干种已报道的表达蛋白酶抑制剂的转基因植物的抗虫的特性植 物基 因类 型目 标 昆 虫烟 草CpTI豇豆丝氨酸PI鳞翅目昆虫：烟草天蛾(Manduca Sexta)烟草夜蛾(Heliothis virescens)烟 草PPI-IITI-II 马铃薯丝氨酸PI番茄丝氨酸PI鳞翅目昆虫：烟草天蛾(Manduca Sexta)烟草夜蛾(Heliothis virescens)烟 草PPI-II 马铃薯丝氨酸PI 鳞翅目昆虫：南方锞纹夜蛾(Chrusodeixis eriosoma)烟 草SpTi-I 甜味
45、马铃薯PI鳞翅目昆虫：淡边翅夜蛾(Spodoptera litura)水 稻CpTI 马铃薯丝氨酸PI鳞翅目昆虫：番茄蛾(Lacanobia oleracea)水 稻PPI-II豇豆PI鞘翅目昆虫：山杨叶甲(Chrysomela tremulae)马铃薯CpTI豇豆PI鳞翅目昆虫：番茄蛾(Lacanobia oleracea)白 杨OCI水稻半胱氨酸PI鞘翅目昆虫：山杨叶甲(Chrysomela tremulae)豌 豆-AI菜豆-淀粉酶I鞘翅目昆虫：四纹豆象(Callosobruchus maculatus)豌 豆-AI菜豆-淀粉酶I鞘翅目昆虫：豌豆象(Bruchus pisorum)Azu
46、kibean-AI菜豆-淀粉酶I鞘翅目昆虫：绿豆象(Callosobruchus chinensis)四纹豆象(Callosobruchus maculatus)鹰嘴豆象(Callosobruchus analis)第49页，讲稿共117张，创作于星期二半胱氨酸蛋白酶抑制剂CysteineproteinaseinhibitorPredictedthreedimensionalstructureoforyzacystatin-I.Oc-(lightblue)ispositionedabovetheactivesiteofpapain木瓜蛋白酶(darkbluewiththeactivecyste
47、ineshowninyellow)toshowhowthetwomoleculesmayinteract半胱氨酸蛋白酶抑制剂半胱氨酸蛋白酶抑制剂(oryzacystatin-)(oryzacystatin-)可以抑制木瓜蛋白酶的活性，其mRNA在水稻开花两周时表达量最高，到种子成熟时则下降到了难以检测的程度。第50页，讲稿共117张，创作于星期二PictureoftomatohairyrootsEffectofhairyrootsexpressingacystatinonthegrowthofGlobodera pallida.Redgrowthcurvedescribesthoseanima
48、lscollectedfromtransgenicplantsexpressingthecystatin,thebluegrowthcurvedescribesanimalscollectedfromwildtypeplants.Picturesshowrepresentativeanimalscollectedfromthetwosetsofplants.Thedensityofanimals,theirgrowth,developmentandfecunditywereallaffected.第51页，讲稿共117张，创作于星期二-淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因-淀物酶抑
49、制剂淀物酶抑制剂(-amylase inhibitor(-amylase inhibitor，-AI)-AI)最初定名为最初定名为凝集素类蛋白质凝集素类蛋白质(lectin-like plotein)(lectin-like plotein)，它在高等植物，尤其，它在高等植物，尤其是禾谷类作物和豆科作物的种子中，存量相当丰富。它们能够同是禾谷类作物和豆科作物的种子中，存量相当丰富。它们能够同一些昆虫肠道中的淀粉酶形成复合物，从而抑制淀粉酶的活性，一些昆虫肠道中的淀粉酶形成复合物，从而抑制淀粉酶的活性，因此因此-淀粉酶抑制剂刘在植物防卫昆虫侵害方面起着重要的作用。淀粉酶抑制剂刘在植物防卫昆虫侵害
50、方面起着重要的作用。-淀粉酶抑制剂、植物凝集素淀粉酶抑制剂、植物凝集素(phytohemagglutinin(phytohemagglutinin，PHA)PHA)以表壳蛋白以表壳蛋白(arcelin(arcelin，ARL)ARL)，三者组成了一种植物防卫蛋白质，三者组成了一种植物防卫蛋白质(plant defence proteins)(plant defence proteins)家族。家族。第52页，讲稿共117张，创作于星期二-淀粉酶抑制剂（淀粉酶抑制剂（-amylase inhibitor）AI-淀粉酶抑制剂淀粉酶抑制剂与哺乳动物或鞘翅目昆虫肠道中的结合-淀粉酶形成复合物的方式，抑