病毒学 病毒侵染与复制.pptx

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1、本章重点1.1.烈性噬菌体繁殖的一般过程2.2.一步生长曲线3.3.病毒核酸的复制4.4.朊病毒的复制与致病机理第1页/共102页 复制（replicationreplication）:病毒感染细胞后，在病毒核酸控制下合成病毒的核酸与蛋白质等成分，然后在宿主细胞的细胞质内或核内装配成病毒颗粒，再以各种方式释放到细胞外，感染其他细胞，这种增殖方式叫复制。第2页/共102页第一节 病毒复制研究的实验系统一、噬菌体细菌培养系统1 1、细菌容易培养，数目易于控制。2 2、形成噬菌斑容易观察。3 3、实验重复快。其相关研究为植物病毒和动物病毒的复制所借鉴。第3页/共102页 二、噬菌体(phage)(p

2、hage)的繁殖噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNADNA上，并且可以随宿主DNADNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。第4页/共102页烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：吸附、侵入、复制、装配和释放。1 1、烈性噬菌体的繁殖第5页/共102页吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性结合，噬菌体以

3、尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉”在细胞表面上。侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。复制 ：包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。第6页/共102页装配：主要步骤有：DNADNA分子的缩合通过衣壳包裹DNADNA而形成头部尾丝及尾部的其它部件独立装配完成头部与尾部相结合最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。第7页/共102页释放：方式：裂解：包括T4T4噬菌体在内的

4、大多数噬菌体以裂解细胞的方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。（丝状噬菌体）通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100300100300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，第8页/共102页第9页/共102页 2 2、一步生长曲线 一步生长曲线是定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。（1 1）实验设计依据：通常噬菌体和细菌的混合比例为1:101:10，保证1 1个菌体只被1 1个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体同步感染。第10页/共102页（2 2）实验过程:敏感菌敏感菌10ml Phage 1ml 混匀，混匀，5min,使之吸附使之吸附 离心或用抗

5、离心或用抗phage血清血清处理理,去除去除过量量phage 高倍稀高倍稀释,吸附吸附phage的菌的菌悬液液(避免多次吸附避免多次吸附)37培养培养,定定时取取样 第11页/共102页噬菌斑:概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。)应用:噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌斑第12页/共102页第13页/共102页 取取样人人为裂解裂解处理（每理（每5min）样品中加入品中加入氯仿裂解仿裂解细胞胞 24-48h 裂解液加入敏感菌液

6、中裂解液加入敏感菌液中 适当稀适当稀释混合液混合液 涂布于涂布于涂布于涂布于琼琼脂培养基上脂培养基上脂培养基上脂培养基上 计数噬菌斑数噬菌斑第14页/共102页 取样（每5min5min）离心除去细菌 上清加入敏感菌液中 适当稀释混合液 涂布 计数噬菌斑 第15页/共102页 以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。可分以下阶段：潜伏期(latent phase)裂解期(burst phase)稳定期(plateau phase)一步生长曲线一步生长曲线第16页/共102页 一步生长曲线第17页/共102页潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时

7、期。曲线平行于横轴，噬菌体数无变化。样品中无游离的噬菌体。(潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数,也就是感染噬菌体的细菌数).).病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病毒的时期为隐蔽期(eclipse period)(eclipse period)。裂解期：曲线直线上升，子代噬菌体不断释放到培养基中,直到达到一个极限。稳定期:感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。第18页/共102页裂解量:每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。稳定期噬菌斑数 裂解量 =潜伏期噬菌斑数 不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同，与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因数

8、有关。T4 T4约为100100，X174X174约为10001000，f2f2高达1000010000、T2T2仅为200200。第19页/共102页 MOI:multiplicity of infection，感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。第20页/共102页 3 3、温和噬菌体与溶源性细菌温和噬菌体(tem

9、perature phage)：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNADNA上，并且可以随宿主DNADNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。原噬菌体（或前噬菌体,prophage,prophage）：即整合在宿主核DNADNA上的噬菌体的核酸。溶原性细菌(lysogenic bacteria)：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。第21页/共102页溶原性细菌的特点：可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNADNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性

10、噬菌体，自发裂解几率1010-2 21010-5-5。可诱导裂解：用化学、物理方法诱导具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。可复愈：自然遗失前噬菌体，但不发生自发裂解和诱导裂解 溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。第22页/共102页 三、动物病毒动物细胞培养系统 20 20世纪5050年代才建立动物细胞体外连续培养技术。体外培养细胞只能近似地反应动物机体内病毒的复制过程。空斑方法 相当数量的病毒不能在细胞培养物中生长第23页/共102页第24页/共102页 植物细胞去掉细胞壁，

11、而仍有代谢活性的原生质部分称为原生质体，2020世纪7070年代建立。原生质体的离体存活能力、生理活性不十分理想，有些植物原生质体的分离、培养与维持还十分困难。目前尚不如动物细胞那样成熟和方便。四、植物病毒植物原生质体培养系统第25页/共102页第二节 病毒的复制周期第26页/共102页一、吸附(adsorption)adsorption)病毒与细胞表面特异的受体结合称为吸附。病毒与细胞的最初结合是可逆的。病毒与受体结构互补后，形成不可逆结合，这时即使洗下病毒颗粒，该颗粒也不具有侵袭性。第27页/共102页决定病毒不可逆结合的因素1 1、病毒吸附蛋白 能够识别并吸附细胞表面受体的病毒表面结构蛋

12、白。T-T-偶数噬菌体的吸附蛋白是噬菌体尾丝蛋白。流感病毒包膜上有两种突起：血凝素和神经氨酸酶，但病毒的感染性只能被抗血凝素的抗血清中和。第28页/共102页 流感病毒外面两种蛋白质突起，一是血凝素，一是神经氨酸酶。病毒血凝素对细胞上含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白有特异的亲和能力。神经氨酸酶与细胞表面黏液蛋白中的神经氨酸也有特异的结合能力，它的作用是从黏液蛋白释放乙酰神经氨酸，因而使得由细胞表面芽生的子代病毒，得以脱离细胞。第29页/共102页2 2、病毒的细胞受体 病毒的细胞受体决定了病毒的宿主范围、组织亲和性、并影响病毒的致病性。细胞的生理状态发生改变，也会影响病毒的吸附。第30页/共102页

13、例如脊髓灰质炎病毒只能附着在灵长类的动物细胞上，而不能吸附在啮齿类动物细胞上。脊髓灰质炎病毒的RNA+柯萨奇病毒的蛋白质衣壳 杂种病毒 侵染小鼠细胞第31页/共102页 噬菌体细胞受体有严格的种系特异性，因而各种噬菌体具有严格的宿主范围，这一特性可作为细菌的分类鉴定指标。第32页/共102页 大多数噬菌体的病毒受体为细菌细胞壁上的磷壁酸分子，脂多糖分子以及糖蛋白复合物，有的则位于菌毛、鞭毛或荚膜上。大部分动物病毒的病毒受体为镶嵌在细胞膜脂质双分子层中的糖蛋白，也有的是糖脂或唾液酸寡糖苷。植物病毒迄今尚未发现有特异性细胞受体。第33页/共102页植物病毒 植物病毒须经机械传递或昆虫介体传递导致感

14、染。不存在吸附蛋白和受体的特异结合，其特异性取决于病毒复制过程的以后各步。第34页/共102页不侵染番茄TMV株系的RNA+侵染番茄TMV株系的外壳 杂种病毒 不侵染侵染番茄TMV株系的RNA+不侵染番茄TMV株系的外壳 杂种病毒 侵染第35页/共102页3 3、环境因数温度：一定温度范围内，病毒的吸附速率与温度成正比。脊髓灰质炎病毒在1时的吸附率仅是37 的十分之一。离子环境：病毒的吸附蛋白与细胞受体主要成分是蛋白质，趋向带负电荷。一般一定浓度的阳离子促进吸附，阴离子无此作用。pH：影响病毒与细胞吸附反应的第一步-静电引力结合。第36页/共102页二、侵入（penetrationpenetr

15、ation）1 1、噬菌体的侵入 T T偶数噬菌体采取注射的方式 其他噬菌体的入侵方式可能不同。第37页/共102页2 2、动物病毒的入侵（1 1）位移：一些裸露的病毒，如脊髓灰质炎病毒在吸附到细胞膜上后壳体发生改变，以便只有核酸进入细胞。（2 2）与细胞膜融合：副黏病毒（有囊膜病毒）（3 3）内吞作用：又称病毒胞饮，呼肠孤病毒、乳多空病毒。（有囊膜及无囊膜病毒）第38页/共102页第39页/共102页3 3、植物病毒（1 1）介体感染：主要通过昆虫。（2 2）非介体感染：即带毒植物的嫁接，带毒花粉的花粉粒萌发，芽管侵入胚胎等均可使病毒进入细胞。第40页/共102页三、脱壳 病毒侵入细胞后，病

16、毒的包膜和衣壳被除去而病毒核酸释放出来的过程。大部分依靠细胞内的蛋白酶进行脱壳，也有病毒表达脱壳酶。第41页/共102页四、病毒大分子的合成 病毒感染细胞后，要么潜伏下来将核酸整合于细胞基因组，成为前病毒随细胞分裂而传递；要么接管细胞的代谢机制，利用细胞合成核酸和蛋白质的原料、场所、机制、能量完成病毒大分子的合成。第42页/共102页 大多数正链RNA病毒的RNA分子直接与核糖体结合，全长或部分进行翻译。其他病毒基因组均需转录为mRNA，再进行蛋白表达。在细胞核内复制的DNA病毒通过细胞的DNA依赖的RNA聚合酶执行转录功能，其他病毒则需由病毒编码独特的转录酶，作为病毒的中间产物。第43页/共

17、102页 病毒大分子的合成包括核酸的复制和基因组的转录。病毒基因组的转录具有严格的时序性，分早期转录和晚期转录。发生在病毒核酸复制以前的转录为早期转录，转录的基因为早期基因，早期蛋白主要参与病毒核酸的复制以及参与抑制宿主细胞大分子的合成。在核酸复制开始或复制后进行的转录称为晚期转录，晚期蛋白主要是病毒的结构蛋白。第44页/共102页1 1、病毒核酸复制概论（1 1）病毒核酸的复制模式：半保留复制和全保留复制。1 1）半保留复制：在新复制的dsDNA中，一条是母体DNA链，另一条是新合成的子代DNA链。是DNA复制普遍遵循的模式，DNA病毒也大多采用此种方式。但也有一些dsRNA病毒采用。第45

18、页/共102页 半保留复制第46页/共102页 2 2）全保留复制 主要是dsRNA病毒，复制时双链基因组仍相互缠绕，只在复制点局部解开几个碱基对，子代双链全是新合成。包括呼肠孤病毒、质型多角体病毒、轮状病毒等。在+ssRNA噬菌体基因组复制时所形成的复制型RF复制子代+RNA链时也存在这种模式。第47页/共102页 全保留复制第48页/共102页（2 2）病毒核酸复制的主要类型：7 7类1971年，Baltimore D根据病毒基因组的复制表达线路，提出了一种分类方法。（+）DNADNA类类 (-)DNA (-)DNA (-)DNA (-)DNA ()DNADNADNADNA类类(+)RNA

19、(+)RNA(+)RNA(+)RNA mRNA mRNA mRNA mRNA(-)RNA(-)RNA(-)RNA(-)RNA类类类类(-)RNA(-)RNA(-)RNA(-)RNA类类()RNA)RNA)RNA)RNA类类后来，学术界将嗜肝DNA病毒科和花椰菜花叶病毒科另列一组，这类病毒的dsDNA复制必须经过逆转录产生DNA(前基因组)第49页/共102页第一类型：dsDNA1）仅在细胞核内复制（疱疹病毒科、腺病毒科、乳头状榴病毒科），需要细胞因子参与。2）细胞质内复制（痘病毒科），能编码转录和复制所需要的因子，不必依赖细胞因子。3）虹彩病毒科，其DNA复制早期在核内，晚期在细胞质中。第50

20、页/共102页 痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、腺病毒：mRNA 蛋白质 dsDNA 病毒组装 dsDNA第51页/共102页病毒（）DNA病毒（）DNA子代病毒即早蛋白早期蛋白晚期蛋白 mRNA mRNA mRNA类第52页/共102页第二类型：ssDNA（细小病毒科），病毒在细胞核内复制，中间可行成双链中间体作为合成正链的模板。大多数ssDNA序列与mRNA极性相同。细小病毒、圆环病毒：mRNA 蛋白质ssDNA dsDNA 病毒组装 ssDNA第53页/共102页病毒（+）DNA子代（+）DNA细胞蛋白病毒蛋白子代病毒 mRNA（）DNA类第54页/共102页第三类型：dsRNA（呼肠孤病毒

21、科），病毒有多片段的基因组，每个片段可单独转录，产生单个的单顺反子mRNA。（也有单片段基因组的）呼肠孤病毒、双RNA病毒：mRNA 蛋白质 dsRNA 病毒组装 dsRNA第55页/共102页病毒（）RNA子代（）RNA病毒蛋白部分装配子代病毒 mRNA病毒酶类第56页/共102页第四类型：+ssRNA（微小RNA病毒科、杯状病毒科、披盖病毒科、黄病毒科、冠状病毒科）微小RNA病毒、杯状病毒、披盖病毒、黄病毒、冠状病毒、动脉炎病毒：蛋白质 （裂解）+ssRNA +ssRNA 病毒组装 -ssRNA dsRNA第57页/共102页1）病毒具有多顺反子mRNA（微小RNA病毒科、杯状病毒科、黄病

22、毒科），合成一个多聚的蛋白产物，随后被切割形成成熟的蛋白质。具有RF中间型。病毒（+）ssRNA子代（+）ssssRNA多聚蛋白蛋白加工子代病毒dsRNA结构蛋白非结构蛋白类第58页/共102页DNA转录多顺反子mRNA启动子基因1基因2基因3DNA转录启动子基因单顺反子mRNA第59页/共102页 RF(replicative form)复制型:是核酸在复制过程中出现的一种结构，一般指单链DNA的病毒或RNA病毒的基因组ssDNA或ssRNA在复制时形成的dsDNA或dsRNA中间分子。第60页/共102页2）病毒具有复杂的转录过程（披盖病毒科、烟草花叶病毒属），其转录的mRNA通常小于基因

23、组RNA，不能做为子代RNA的复制模板。中间过程无RF出现。病毒（+）ssRNA子代（+）ssRNA非结构蛋白mRNA子代病毒结构蛋白类全长（-）ssRNA第61页/共102页第五类型：-ssRNA（正黏病毒科、单负股病毒目）正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、丝状病毒等：蛋白质-ssRNA +ssRNA 病毒组装 -ssRNA第62页/共102页分段的基因组（正黏病毒科），复制在细胞核发生，复制的第一步是，病毒粒子的RNA依赖的RNA聚合酶转录产生单顺反子mRNAs，该mRNA也作为模板启动基因组复制；病毒（-）ssRNA子代（-）ssRNA病毒蛋白子代病毒mRNA类病毒酶第63页/共102页非分

24、段的基因组（单负股病毒目），从全长的病毒基因组产生多个单顺反子mRNAs，产生多个mRNA的机制有两种可能，一种是转录后形成的全长转录本经剪切产生多个mRNA；另一种是病毒基因组内存在转录起始与终止的信号。病毒（-）ssRNA子代（-）ssRNA病毒蛋白子代病毒（+）ssRNA类病毒酶mRNA第64页/共102页第六类型：+ssRNA，其基因组为二倍体，具有DNA 中间体（反转录病毒科），它不作为mRNA而是反转录为DNA。反转录病毒：mRNA 蛋白质+ssRNA dsDNA 整合到宿主 病毒组装 细胞基因组 +ssRNA 第65页/共102页病毒2（+）ssRNA前病毒 dsDNA子代病毒（

25、+）ssRNA（-）ssDNA类病毒反转录酶mRNA病毒蛋白第66页/共102页第七类型：dsDNA，具有RNA中间体（嗜肝DNA病毒科、花椰菜花叶病毒科），与第六类型不同，其反转录过程发生在病毒粒子成熟过程中。当病毒感染新细胞时，首先是修复缺损的基因，然后再转录。其dsDNA为开环结构。嗜肝病毒：ss/dsDNA mRNA 蛋白质 病毒组装 dsDNA ss/dsDNA第67页/共102页病毒开环 dsDNA超螺旋 dsDNA子代病毒（-）ssDNA（+）ssRNA类反转录病毒蛋白dsDNA第68页/共102页五、病毒的装配与释放 病毒大分子合成产生的结构组分能以一定的方式结合，组装成完整子

26、代病毒颗粒。这一复制阶段称为装配。绝大多数DNA病毒在细胞核内组装，RNA病毒与痘病毒类则在细胞质内组装。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。第69页/共102页 有些病毒（烟草花叶病毒）的壳体蛋白质亚基能以类似结晶作用的方式自发装配成病毒壳体。另一种方式为指导装配，有病毒基因组编码的非结构蛋白（脚手架蛋白、蛋白水解酶）参与，前者在装配中有瞬时功能，完毕后，或参与另一轮的病毒装配，或被除去。后者对前体蛋白进行加工，稳定装配步骤。第70页/共102页 绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞

27、迅即死亡。绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000100-1000。第71页/共102页 植物病毒大多数没有囊膜，结构相对简单，核衣壳大都以自我装配的方式成熟。植物病毒一般不裂解细胞，而是通过胞间连丝传递给相邻的细胞。第72页/共102页第73页/共102页第74页/共102页第三节 病毒的异常复制 1、缺损病毒：有些病毒由于缺乏某些基因，单独感染细胞时不能复制出完整的、具有

28、感染性的病毒颗粒，需要其它病毒基因组或病毒基因的辅助活性，否则，即使在活细胞内也不能复制。有生物活性的缺损病毒包括4类：第75页/共102页 干扰缺损病毒：又称干扰缺损颗粒（defective interfering particles,DI颗粒），是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体，必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。DI基因组比其完全病毒小，复制更迅速，在与其完全病毒共感染时易占据优势，从而干扰其复制。第76页/共102页 卫星病毒：寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒。基因组缺损，必须依赖于辅助病毒才能复制，它不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，是存在于自然界中一种绝对缺损病毒

29、，形态结构和抗原性都与辅助病毒不同，基因组很少有同源性。卫星病毒现划归在亚病毒因子的卫星之中。第77页/共102页 条件缺损病毒：是一类基因组发生了突变的病毒条件致死突变体，在允许条件下能够正常繁殖，在限制条件下导致流产感染，也能干扰野生型病毒复制。第78页/共102页 整合的病毒基因组：某些温和噬菌体和肿瘤病毒感染宿主细胞后，病毒基因组整合于宿主染色体，并随细胞分裂传递给子代细胞。除非缺损的外源性RNA肿瘤病毒外，病毒整合感染的细胞没有感染性的病毒产生，只有在一定条件下，整合在宿主染色体的病毒基因组才能转入复制循环，产生有感染性的病毒颗粒。第79页/共102页2、顿挫感染(abortive

30、infection)：病毒进入宿主细胞，若细胞缺乏病毒复制所需的酶、能量和原料等，则病毒不能合成本身成分；虽合成部分或全部成分，不能装配和释放，称为顿挫感染。这类感染过程有以下2种类型：第80页/共102页 流产感染：流产感染分为依赖于细胞的流产感染和依赖于病毒的流产感染。病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞，将导致依赖于细胞的流产感染。非允许细胞内，缺失某些参与病毒复制的酶、tRNA或细胞因子，仅有少数病毒基因表达，不能完成病毒复制循环。依赖于病毒的流产感染是由基因组不完整的缺损病毒引起，无论是感染允许细胞还是非允许细胞都不能完成复制循环。第81页/共102页 限制性感染：因细胞的瞬时性

31、允许产生，其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制，直到细胞成为允许性细胞，才开始复制，或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。第82页/共102页第四节 朊病毒 朊病毒（Prion,简称PrPsc）是20世纪80年代发现的一种不含核酸的蛋白质传染性颗粒，是包括人在内所有动物中都具有的正常细胞朊蛋白(PrPc)的同源异构体。正常细胞朊蛋白在未知因素的作用下，性质发生改变（如空间结构的改变），成为引起疾病的的病原体。朊病毒能够在人及动物中引起一组疾病，命名为传染性海绵状脑炎（transmissible spongiform encephalopathie,TSE）第83页/共102页美国加

32、州大学旧金山分校神经科主任Prusiner于80年代初首次发现，并因此获1997年诺贝尔生理学和医学奖第84页/共102页 使普通DNA及RNA病毒失去感染性的紫外光剂量不能使脑组织匀浆中的朊病毒蛋白失去感染性。蛋白提取物经DNA酶及RNA酶作用后仍具有较强的感染性。经蛋白酶、蛋白变性剂处理后，蛋白提取物失去感染性。福尔马林溶液不能完全消除朊病毒的感染性。蛋白质致病假说的依据蛋白质致病假说的依据第85页/共102页PrPsc与PrPc的基本特征比较1.朊病毒是一种蛋白酶抗性蛋白（proteinase resistant protein,PrP）。表达组织：中枢神经系统、淋巴系统。存在位置：细胞

33、膜。无核酸结构，可抵抗非变性去污剂、核酸酶的作用。因其分子量为2730kD，称为PrP2730。第86页/共102页2.正常人和动物的神经细胞编码这一蛋白的前体分子，被称之为PrPc（cellular isoform of PrP），分子量3335kD对蛋白酶敏感。为区别朊病毒，将细胞编码的PrP称之为PrPc，朊病毒缩写为PrPsc（scrapie isoform of PrP）在未知因素的作用下，PrPc分子构型发生改变，成为PrPsc。第87页/共102页耐受蛋白酶的消化和常规消毒作用，只有强碱(10N NaOH)，高压消毒(136，2小时)才能灭活；2.不含核酸，用常规PCR无法检测；

34、3.超长的潜伏期（平均20年），发病前无法检测和诊断；4.变异和跨种族感染，具有大量的潜在感染来源，主要为牛、羊等反刍动物，传播的潜在危险不明，很难预测和控制；5.感染途径多已知有消化道（食入）、神经、血液均可感染；由正常PrPc转化成恶性PrPsc的机理和因素不清，难以预防；6.100%病死率，缺乏治疗药物，无法研制预防疫苗；7.异种间朊病毒感染，受感染动物体内的朊病毒为该种特异的朊病毒。朊病毒的特殊性质第88页/共102页1.羊瘙痒病（scrapie）2.疯牛病（bovine spongiform encephalopathy,BSE）3.库鲁病（Kuru）4.克-雅氏症（Creutzef

35、eldt-jakob disease,CJD）传染性病毒性痴呆（transmissible virus dementia,TVD）5.致死性家族性失眠症（fatal familial insomnia,FFI）6.吉斯特曼-斯召斯列综合征（Gerstmann-Straussler syndrome,GSS）朊病毒感染引起人和动物的主要疾病第89页/共102页中枢神经系统进行性退行性海绵样病变,四大神经病理特征：1.神 经 元 细 胞 空 泡 变 性 或 海 绵 样 变（Spongiform changes）2.神经元退化、丢失(Neuron loss)3.星形细胞增生（Astrocytosis

36、），取代正常的神经元细胞4.形成淀粉样斑沉积(Amyloidosis)朊病毒病的共同病理特点第90页/共102页朊病毒的分子特征The characteristics of the PrP molecule 人类PrP基因位于第20号染色体。mRNA转译出253个aa长的多肽链。多肽氨基端含5个八肽重复序列，两个糖基化位点，及一个二硫键。PrPc结构中含有3个-螺旋结构，两个反向平行的-片层结构。多肽链羧基末端的磷脂酰肌醇使朊蛋白附着在细胞膜表面。第91页/共102页PrPc与PrPsc分子结构特征比较PrPc二级结构中主要以-螺旋结构为主，约占40%，仅存在少量-片层结构。溶解于非变性剂溶液

37、，对蛋白酶K敏感。2.PrPsc含有50%的-片层结构，20%的-螺旋。不溶于非变性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的PrP2730。第92页/共102页羊瘙痒病PrPC与PrPSC的三维结构 折叠折叠PrPC（正常）PrPSC（致病）第93页/共102页 模板模式：X蛋白与H2和H3-螺旋区域结合形成PrPc与X蛋白结合的中间体PrP*，PrP*促进PrPc氨基末端与PrPsc结合，PrPsc作为模板催化PrPc构型发生改变。PrPc转化为PrPsc的模式The model of conversion of PrPc to PrPscPrP

38、c PrP*+PrPsc 2PrPsc proteinX第94页/共102页晶种模式：PrPsc作为“晶种”聚集PrPc使其构型发生改变，成为PrPsc。PrPscPrPcPrPscPrPcPrPscPrPscPrPcPrPcPrPscPrPscPrPscPrPscPrPcPrPscrPscPscPcPPPPPPPPPPPrPsc from:PrPsc-PrPcComplexformsPrPc converted To New PrPscAdditionalPrPc recruitedRecruitment of PrPc by PrPsc Becomes more efficient as

39、PrPsc levels increas PrPsc accumulation results in cellular dysfunction and neuronal death第95页/共102页突变：家族性致死性失眠症的发病多由于PrP基因发生变异，在没有外源性PrPsc存在的环境中自发转变为PrPsc。在八肽重复区中氨基酸的插入突变与家族性CJD的发生密切相关。第96页/共102页朊病毒病的诊断 Diagnosis of prion disease1.动物接种实验：尸检脑组织病理学特征2.免疫学诊断：利用可以区分PrPsc和PrPc的单克隆抗体第97页/共102页结论与展望 疯牛病及朊

40、病毒病和艾滋病被认为是上个世纪末的两大顽疾。朊病毒病是一种新型的传染病，有关的研究可能会丰富我们生物化学和分子生物学的内容。朊病毒的发现是生物学上的又一次革命性的突破，表示蛋白质构型与DNA、RNA一样可以提供感染源的生物信号。第98页/共102页 另1996年8月出版的Science上，芝加哥大学的遗传学家Susan Lindguist报道，在酵母中也存在着朊病毒，并与哺乳类的朊病毒相似。这一发现使我们想到在其他生物中是否也含有朊病毒及其造成的传染病。这些都需要进一步的研究。第99页/共102页习题1.何谓病毒的MOI及一步生长曲线？二者有何关系？2.解释病毒的复制周期及隐蔽期3.举例说明病毒的特异性吸附与细胞受体的关系4.病毒的生物合成有何特点？5.病毒蛋白如何翻译和加工？6.什么是病毒的自我组装？什么样的病毒可以自我组装？7.有囊膜的病毒如何成熟与释放？第100页/共102页 The single biggest threat to mans continued dominance on the planet is the virus.Joshua Lederberg Nobel laureate第101页/共102页感谢您的观看！第102页/共102页