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1、病 毒 学1第二章第二章 病病 毒毒 的的 复制复制第二节第二节病毒复制的机理与病毒复制的机理与一步生长曲线一步生长曲线2 1、双链、双链DNA病毒病毒 2、单链、单链DNA病毒病毒 3、双链、双链RNA病毒病毒 4、单正链、单正链RNA病毒病毒 5、单负链、单负链RNA病毒病毒 6、逆转录病毒、逆转录病毒二、病毒复制的机理二、病毒复制的机理31AAmRNA72345AAmRNA6131415PAPB1PB2HANAM2NPM1NS1NS28129a9b10bcRNA10avRNA11Oseltamivir (奥司他韦奥司他韦)Amantadine (金刚烷胺金刚烷胺)Leptomycin B
2、 (来普霉素来普霉素B)4亲代病毒粒子（1）吸附、穿入、脱壳（胞浆）（2）病毒DNA(核内)早期mRNA(胞浆)早期蛋白（3）T抗原（5）（4）酶类（转录酶转录酶）子代病毒DNA晚期mRNA病毒结构蛋白子代病毒粒子（6）（7）（8）（9）宿主细胞的核酸聚合酶宿主细胞的核酸聚合酶宿主细胞转录酶宿主细胞转录酶5亲代病毒粒子脱去外胞膜、暴露髓核（胞浆）吸附、穿入细胞酶病毒携带的转录酶病毒携带的转录酶早期mRNA70多种早期蛋白（DNA聚聚合酶、脱壳酶、转录酶合酶、脱壳酶、转录酶）病毒DNA子代DNA晚期mRNA结构蛋白子代病毒6病毒复制的机理病毒复制的机理嗜肝嗜肝DNA病毒复制：病毒复制：乙型肝炎病
3、毒乙型肝炎病毒 (HBV)：双链DNA反转录病毒、双链不完全环形DNA分子、3.2 Kbp_宿主细胞的宿主细胞的RNA聚合酶聚合酶II7病毒的类病毒的类DNA多聚酶蛋白多聚酶蛋白(P蛋白蛋白)嗜肝嗜肝DNA病毒复制：病毒复制：嗜肝嗜肝DNA病毒的病毒的单细胞复制循环单细胞复制循环途径途径1：提供额外拷贝的共价闭合：提供额外拷贝的共价闭合环状附加体环状附加体DNA （早期早期）途径途径2：有包膜的病毒粒子从内质：有包膜的病毒粒子从内质网（网（ER）中输出的情况（）中输出的情况（后期后期）8亲代病毒粒子吸附、穿入、脱壳（胞浆）病毒DNA(+DNA)DNA(复制中间体) DNA早期mRNA早期蛋白晚
4、期mRNA晚期蛋白子代核酸子代病毒细胞细胞DNA聚合酶聚合酶细胞细胞DNA聚合酶聚合酶宿主细胞转录酶宿主细胞转录酶9亲代病毒吸附、穿入、脱去外衣壳（内衣壳、 RNA 、RNA聚合酶）细胞酶病毒病毒RNA聚合酶聚合酶亲代两条链不断打开和再结合，使RNA得以大量扩增大部分mRNA早期蛋白cRNA晚期蛋白子代病毒10亲代病毒吸附、穿入、脱衣壳+ 早期蛋白（早期蛋白（RNA聚合酶）聚合酶）子代核酸晚期蛋白子代病毒11亲代病毒吸附、穿入、脱衣壳病毒特异的病毒特异的RNA聚合酶聚合酶mRNA(5加帽状结构）病毒酶类、结构蛋白复制病毒负RNA模板子代病毒核酸裸露的子代病毒帽状结构：5m7G53 121314
5、+RNP反转录酶反转录酶35sDNARNA: DNA10s+DNA核酸酶降解DNA在许可性细胞内，受病毒特定基因的控制整合到宿主染色体细胞细胞RNA聚合酶聚合酶II35s+RNA、22s+RNA、14s+RNA核衣壳蛋白膜蛋白反转录酶 +RNA子代病毒15 Attachment Fusion Release of RNAReverse transcription Integration Transcription Maturation and buddingAssembly Attachment Fusion Release of RNAReverse transcription Integr
6、ation TranscriptionAssembly1617效价 (titre titer)：表示每毫升试样中所含有 的具侵染性的噬菌体粒子 数，又称噬菌斑形成单位 数（plaque-forming unit， pfu）或感染中心数（in- fective centre）。精确的测定方法：双层平板法（two layer plating method）三、一步生长曲线三、一步生长曲线 (one-step growth curve) 噬菌斑的形成实验噬菌斑的形成实验18双层平板法底层平板（2琼脂培养基10 mL）上层平板上层培养基（1琼脂培养基5 mL）宿主菌悬液（对数期菌液0.2 mL）噬菌体
7、试样（合适稀释液0.1 mL）混匀3710余小时计数噬菌斑三、一步生长曲线三、一步生长曲线 (one-step growth curve) n1939年，年，n具体操作是具体操作是: :n将噬菌体的稀释液感染高浓度的大肠杆菌；将噬菌体的稀释液感染高浓度的大肠杆菌；n数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清 ( (中和未吸附的噬中和未吸附的噬菌体菌体) )；n将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其他细胞；释放的噬菌体感染其他细胞；n保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效
8、价 ( (对噬菌对噬菌体的含量进行计数体的含量进行计数) )；n以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线。制出病毒特征性的繁殖曲线。1920一步生长曲线实验将培养物直接将培养物直接测定病毒数量测定病毒数量将细胞裂解测定将细胞裂解测定病毒数量病毒数量前期可将培养物前期可将培养物先离心去上清以先离心去上清以消除未吸附病毒消除未吸附病毒的影响的影响21潜伏期潜伏期 (1atent period) 是指病毒吸附于细胞到受是指病毒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒所染细胞释放出子代病毒所需的最短时间需的最短时间病毒在感染细胞内消
9、失到细胞病毒在感染细胞内消失到细胞内重新出现新的感染病毒的时内重新出现新的感染病毒的时期为期为隐蔽期隐蔽期 (eclipse period)。人为裂解病毒感染细胞，在潜人为裂解病毒感染细胞，在潜伏期前一阶段，受染细胞内检伏期前一阶段，受染细胞内检测不到感染性病毒，在后一阶测不到感染性病毒，在后一阶段感染性病毒在受染细胞内数段感染性病毒在受染细胞内数量急剧增加。量急剧增加。1、潜伏期、潜伏期22隐蔽期病毒在细胞内存隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线在的动力学曲线呈线性呈线性函数函数，而，而非指数关系非指数关系，从而证明子代病毒颗粒从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因是由新合成的病毒基因组与蛋
10、白质经装配成熟，组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式而不是通过双分裂方式产生的。产生的。23潜伏期后宿主细胞裂解释潜伏期后宿主细胞裂解释放出大量子代病毒的时期放出大量子代病毒的时期称为裂解期称为裂解期 (rise phase) 或成熟期。或成熟期。在潜伏期后，病毒效价急在潜伏期后，病毒效价急剧增加，这是新合成的病剧增加，这是新合成的病毒核酸和蛋白质装配成大毒核酸和蛋白质装配成大量病毒粒子，并释放的结量病毒粒子，并释放的结果。果。2、裂解期裂解期24裂解期末，受染细胞将子代病裂解期末，受染细胞将子代病毒粒子全部释放出来，病毒效毒粒子全部释放出来，病毒效价稳定在最高处的时期，价稳定在最高处的
11、时期，称为称为平稳期平稳期(plateau phase)。3、平稳期平稳期裂解量裂解量 (burst size) 是指每个是指每个受染细胞产生的子代病毒粒子受染细胞产生的子代病毒粒子的平均数目的平均数目，其值等于平稳期，其值等于平稳期受染细胞释放的全部子代病毒受染细胞释放的全部子代病毒粒子数除以潜伏期受染细胞的粒子数除以潜伏期受染细胞的数目，即数目，即平稳期病毒效价与潜平稳期病毒效价与潜伏期病毒效价之比伏期病毒效价之比。裂解量取。裂解量取决于病毒和宿主细胞。决于病毒和宿主细胞。25三、一步生长曲线三、一步生长曲线以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的
12、敏感细胞，待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒待病毒吸附后，离心除去未吸附的病毒，或以抗病毒抗血清处理病毒抗血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，然后细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以继续培养并定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线一步生长曲线。噬菌体复制研究噬菌体复制研究动植物病毒的复制研究动植物病毒的复制研究潜伏期：潜伏期：不同病毒潜伏期长短不一，噬菌体一般有不同病毒潜伏期长短不一，噬菌体一般有几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量：裂解量： 噬菌体：几十到上百，动植物病毒：数百乃至上万噬菌体：几十到上百，动植物病毒：数百乃至上万26