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1、8.1 基因工程与环境保护8.2 细胞工程与环境保护8.3 酶工程与环境保护8.4 发酵工程与环境保护第1页/共42页8.1 基因工程与环境保护基因工程 是将某一生物（供体）的基因片段在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使外源基因在受体细胞中得以表达和遗传第2页/共42页基因工程的特点 能按人们预先的设计对基因进行拼接，且能打破物种间的界限，是一种生物的遗传信息在另一种生物中得以遗传、表达。第3页/共42页采用基因工程技术构建的基因工程菌应用与发酵工业和医药工业，能提高传统发酵产品的产率，向人们提供只有动物体内才能生产的物质如抗原、抗体等；同合
2、成法相比，节约大量原辅材料，大大减少了原材料资源的过度浪费和工业废弃物的排放，减轻了环境污染。第4页/共42页通过转基因技术，有可能把许多作物的优点，如优质高产、抗逆、抗病虫害、耐寒、耐酸碱等基因在某一品种上综合表达，从而大大减少了农药化肥对环境的污染。通过转基因技术构建的基因工程菌，可以处理某些环境中难以降解污染物第5页/共42页8.1.1构建基因工程菌降解污染物n质粒质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子，并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。第6页/共42页大肠杆菌质粒的分子结构示意图
3、大肠杆菌的质粒是最常用的质粒。第7页/共42页n一般说复合以下3条标准的染色体外的DNA或RNA分子可以称为质粒（1）染色体外能自主复制的遗传因子（2）不具备胞外期的感染性（但可认为转化细胞）（3）对宿主来说不是必需的第8页/共42页构建菌株 通常是构建一质粒，使该质粒具有编码周围或中心酶系的基因，它是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，打破生物种属界限，进行种属内外基因重组、遗传信息交换和转移，使之具有人们所期望的性状第9页/共42页降解性质粒可通过接合方式在种内、种间转移，构建包含多组合质粒的工程菌株。1975年，有人将CAMOCT、NAH、TOL质粒通过接合，
4、转移到一株假单胞菌中，得到能降解多种碳氢化合物的“超级细菌”，在几小时内可将原油中60的烃类分解。第10页/共42页中科院武汉病毒所和广东省微生物研究所在国内开创了细菌降解质粒及质粒分子育种的系统研究工作。通过基因克隆，构建了甲苯降解质粒pMT74，多氯联苯质粒pcW6和多氯联苯降解菌pcB12及2-萘酸降解菌的基因库。第11页/共42页用生物技术手段构建含有“自杀基因”的微生物，当其将污染物分解完成后，“自杀基因”就使微生物自我毁灭，不对人类及环境造成危害第12页/共42页应用基因工程菌净化污染物的主要优点：集中构建目的基因，提供综合性代谢新污染物的通路和杂种细胞提高代谢通路结构基因表达，针
5、对新的污染物，改变表达的调节率防止有毒终端污染物的产生，防止非需要产品的出现，用确定的基因实现最初的目的第13页/共42页应用基因工程菌需要进一步研究的内容：目的基因的定位和调节工程菌在生物处理构筑物中的生存能力克隆基因的表达能力第14页/共42页8.1.2 转基因植物防止病虫害据统计，虫害每年给农业造成的损失达13，尤其是由于虫害对化学农药产生的抗药性，使得化学农药控制虫害的方法在生产上受到限制第15页/共42页人工合成的杀虫剂在消除害虫的同时也污染环境，如使野生鸟类产蛋率下降，蛋壳变薄。许多杀虫剂对人类产生急性毒性，还会产生致癌、致畸、致突变的遗传毒性。抗虫基因工程研究为控制害虫危害农业提
6、供了新思路。第16页/共42页利用基因工程技术可以把外源抗性基因转至农作物中并使其表达，从而使农作物得到抗性。目前研究最多的是应用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因来获得抗虫植物。第17页/共42页苏云金芽孢杆菌革兰氏阳性菌，于1902年首次在日本发现其在芽孢形成期，形成大量的伴孢晶体，晶体是由原毒素亚单位（-内毒素内毒素）组成；大多数能同时产生几种晶体蛋白，每种蛋白均具有高度特异的杀虫活性。第18页/共42页中科院农业科学院生物技术研究中心已将苏云金芽孢杆菌毒性蛋白的基因，转移到水稻细胞的原生质体中，并培养出正常水稻幼苗；水稻组织中含有苏云金芽孢杆菌毒性蛋白的基因，使水稻自身就可能产生抗虫害的能
7、力。第19页/共42页携带能杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因的转基因植物有烟草、棉花、番茄等；此外，将抑制昆虫蛋白酶活性的基因引入到棉花和马铃薯中，可以使昆虫进食叶片后因肠消化功能被干扰而最终死亡。第20页/共42页转基因植物研究中最突出的问题可能是昆虫对植物产生的抗性。研究表明，与昆虫产生抗性有关的基因是隐性基因，因此，在一个昆虫群体中有足够多的敏感昆虫存在，那么昆虫抗性基因控制的性状出现的频率将会很小。第21页/共42页由于生物的共进化，如果抗性植物能在不良环境下生长，那么引起病虫害的病毒和昆虫也会很快产生对不良生境的适应性；如果抗性是由单基因控制的，那么只需210年植物就会失去对
8、病虫害的抗性；所以今后不但要培育多基因抗性的品种，而且被选用的多基因应该来自亲缘关系不甚密切的植物。第22页/共42页转基因作物的大量种植有可能给环境生态带来意料不到的严重后果。目前国家对野生水稻已采取保护措施。采取时间隔离、空间隔离和遗传隔离等方法，也许能控制植物基因逃逸并降低其对环境生态带来危害的几率。第23页/共42页8.2 细胞工程与环境保护1.细胞工程 细胞工程是将细胞或原生质体在离体条件下进行培养、繁殖和精细的人工操作，使其某些特性人为地发生改变，从而达到生产生物制品及其组分、改良生物品种或创造新物种的目的。8.2.1 基本概念第24页/共42页迄今为止，人们已经从基因水平、细胞器
9、水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作，在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果，其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景。第25页/共42页1838，哈泊兰德预言了植物细胞的全能性；1907，美国哈里森培养了蛙胚神经组织；1934，荷兰温特发现生长素；1960，英国诺丁汗大学科金教授使用酶解方法从番茄幼苗根部制备得到大量原生质体；n n 细胞工程的发展历史第26页/共42页1972，美国卡尔森等用NaNO3为融合诱导剂，将来自不同种的烟草原生质体进行融合，获得世界上第一个体细胞杂种植株；1977，英国胚胎工程技术，首例试管婴儿；1997，
10、多莉克隆羊；2001，首例克隆猪第27页/共42页动植物细胞与组织培养；细胞融合；染色体工程；胚胎工程；细胞遗传工程l l 主要研究内容第28页/共42页优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；新型动植物品种的培育；供医学器官修复或者移植的组织工程；转基因动植物的生物工程反应器；在遗传学、发育学等领域的理论研究；在能源、环保等领域的应用。细胞工程重要应用第29页/共42页2.原生质体融合 是指将两个亲株的细胞壁分别通过酶解去除，然后在高渗条件下使两原生质体融合，从而获得发生了基因重组融合子的过程。第30页/共42页第31页/共42页3.
11、原生质体技术 包括原生质体制备、培养、融合、再生，原生质体转化等过程。优点是将两亲本的整个基因组强迫性混杂在一起，为异源DNA片段交叉互换创造一个优良的环境。第32页/共42页4.原生质体制备 制备原生质体过程一般采用酶解法细菌等微生物没有坚固的细胞壁，而且细胞外周的化学成分因种属不同而差异甚远，但制备原生质体过程一般也采用酶解法。第33页/共42页酵母菌原生质体制备一般取对数生长早期的细胞，菌悬液浓度为107个mol，在高渗缓冲溶液中用蜗牛酶处理去壁。此外，对酵母细胞进行酶解处理前，用某些含巯基化合物如-巯基乙醇进行预处理可以松动细胞壁结构蛋白，有利于酶解。第34页/共42页对于原核生物中的
12、革兰氏阳性菌，制备原生质体时应针对不同的种属采用不同的溶菌酶浓度处理。小球菌属只需用1g/ml，枯草甘菌属则需要高达50g/ml，有时还需要加一定浓度的青霉素。第35页/共42页丝状真菌一般采用含葡萄糖苷酶、几丁质酶、纤维毒素酶及果胶裂解酶复合物处理，以6mol/LMgSO4作为原生质体稳定剂；曲霉属，有人推荐使用Bacil-lus circulan IAM1165酶和几丁质酶处理，用含有0.8mol/L山梨醇、0.6KCL及0.8Mininol做原生质体稳定剂，再生频率大于30第36页/共42页5.促融因子 常用的有聚乙二醇（PEG）及Ca2+作为促融剂。细菌一般用3050（m/V）PEG，
13、同时可加入Ca2+和DMSO进一步促进融合，时间仅需1min；真菌则采用2530高相对分子质量的PEG，pH9.0较好，同样Ca2+可提高融合效率。第37页/共42页细胞融合技术在废水处理工程菌研究中的应用始于20世纪80年代。利用原生质体融合技术，可将多个细胞的优点集中于一个细胞内。8.2.2 细胞融合构建环境工程菌第38页/共42页程树培等将真核微生物酿酒酵母Y9407与原核微生物光合细菌球型红假单胞菌P9479的原生质体，经跨界融合构建出的融合细胞Foa和Fzl；通过链霉素和制霉菌素的抗性实验，细胞形态学观察，DNA含量分析和对捕光蛋白基因pucBA进行聚合酶链反应，证实该细胞为真正的融合细胞。第39页/共42页融合细胞在耐酸耐热、絮凝性、降解效率、菌体得率多方面综合了双亲的优势，可望较好的应用于高浓度污水生物处理。第40页/共42页8.3 酶与环境保护8.4 发酵工程与环境保护第41页/共42页感谢您的观看！第42页/共42页