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1、第八章第八章 现代生物技术在环境保现代生物技术在环境保护中的应用护中的应用 l l8.1 8.1 基因工程与环境保护基因工程与环境保护l l8.2 8.2 细胞工程与环境保护细胞工程与环境保护l l8.3 8.3 酶工程与环境保护酶工程与环境保护l l8.4 8.4 发酵工程与环境保护发酵工程与环境保护8.1 基因工程与环境保护基因工程与环境保护l l基因工程基因工程 是将某一生物（供体）的基因片段在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使外源基因在受体细胞中得以表达和遗传l l基因工程的特点基因工程的特点 能按人们预先的设计对基因进行拼接，且能打
2、破物种间的界限，是一种生物的遗传信息在另一种生物中得以遗传、表达。l l采用基因工程技术构建的基因工程菌应用与发酵工业和医药工业，能提高传统发酵产品的产率，向人们提供只有动物体内才能生产的物质如抗原、抗体等；l l同合成法相比，节约大量原辅材料，大大减少了原材料资源的过度浪费和工业废弃物的排放，减轻了环境污染。l l通过转基因技术，有可能把许多作物的优点，如优质高产、抗逆、抗病虫害、耐寒、耐酸碱等基因在某一品种上综合表达，从而大大减少了农药化肥对环境的污染。l l通过转基因技术构建的基因工程菌，可以处理某些环境中难以降解污染物8.1.1构建基因工程菌降解污染物构建基因工程菌降解污染物n n质粒
3、质粒 质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子，并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。分子量在1-200kb之间。大肠杆菌质粒的分子结构示意图大肠杆菌质粒的分子结构示意图 大肠杆菌的质粒是最常用的质粒。大肠杆菌的质粒是最常用的质粒。n n一般说复合以下3条标准的染色体外的DNA或RNA分子可以称为质粒（1）染色体外能自主复制的遗传因子（2）不具备胞外期的感染性（但可认为转化细胞）（3）对宿主来说不是必需的l l构建菌株构建菌株 通常是构建一质粒，使该质粒具有编码通常是构建一质粒，使该质粒具有编码周围或中心酶系的基因，它是
4、应用周围或中心酶系的基因，它是应用DNADNA重组重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，打破生物种属界限，进行变生物遗传性，打破生物种属界限，进行种属内外基因重组、遗传信息交换和转移，种属内外基因重组、遗传信息交换和转移，使之具有人们所期望的性状使之具有人们所期望的性状l l降解性质粒可通过接合方式在种内、种间降解性质粒可通过接合方式在种内、种间转移，构建包含多组合质粒的工程菌株。转移，构建包含多组合质粒的工程菌株。l l19751975年，有人将年，有人将CAMOCTCAMOCT、NAHNAH、TOLTOL质粒通质粒通过接合，转移到一株假单
5、胞菌中，得到能过接合，转移到一株假单胞菌中，得到能降解多种碳氢化合物的降解多种碳氢化合物的“超级细菌超级细菌”，在，在几小时内可将原油中几小时内可将原油中6060的烃类分解。的烃类分解。l l中科院武汉病毒所和广东省微生物研究所中科院武汉病毒所和广东省微生物研究所在国内开创了细菌降解质粒及质粒分子育在国内开创了细菌降解质粒及质粒分子育种的系统研究工作种的系统研究工作。l l通过基因克隆，构建了甲苯降解质粒通过基因克隆，构建了甲苯降解质粒pMT74pMT74，多氯联苯质粒，多氯联苯质粒pcW6pcW6和多氯联苯降解菌和多氯联苯降解菌pcB12pcB12及及2-2-萘酸降解菌的基因库。萘酸降解菌的
6、基因库。l l用生物技术手段构建含有用生物技术手段构建含有“自杀基因自杀基因”的微的微生物，当其将污染物分解完成后，生物，当其将污染物分解完成后，“自杀基自杀基因因”就使微生物自我毁灭，不对人类及环境就使微生物自我毁灭，不对人类及环境造成危害造成危害l l应用基因工程菌净化污染物的主要优点：应用基因工程菌净化污染物的主要优点：集中构建目的基因，提供综合性代谢新污集中构建目的基因，提供综合性代谢新污染物的通路和杂种细胞染物的通路和杂种细胞 提高代谢通路结构基因表达，针对新的污提高代谢通路结构基因表达，针对新的污染物，改变表达的调节率染物，改变表达的调节率 防止有毒终端污染物的产生，防止非需要防止
7、有毒终端污染物的产生，防止非需要产品的出现，用确定的基因实现最初的目产品的出现，用确定的基因实现最初的目的的l l应用基因工程菌需要进一步研究的内容：应用基因工程菌需要进一步研究的内容：目的基因的定位和调节目的基因的定位和调节 工程菌在生物处理构筑物中的生存能力工程菌在生物处理构筑物中的生存能力 克隆基因的表达能力克隆基因的表达能力8.1.2 转基因植物防止病虫害转基因植物防止病虫害l l据统计，虫害每年给农业造成的损失达13，尤其是由于虫害对化学农药产生的抗药性，使得化学农药控制虫害的方法在生产上受到限制l l人工合成的杀虫剂在消除害虫的同时也污人工合成的杀虫剂在消除害虫的同时也污染环境，如
8、使野生鸟类产蛋率下降，蛋壳染环境，如使野生鸟类产蛋率下降，蛋壳变薄。变薄。l l许多杀虫剂对人类产生急性毒性，还会产许多杀虫剂对人类产生急性毒性，还会产生致癌、致畸、致突变的遗传毒性。生致癌、致畸、致突变的遗传毒性。l l抗虫基因工程研究为控制害虫危害农业提抗虫基因工程研究为控制害虫危害农业提供了新思路。供了新思路。l l利用基因工程技术可以把外源抗性基因转利用基因工程技术可以把外源抗性基因转至农作物中并使其表达，从而使农作物得至农作物中并使其表达，从而使农作物得到抗性。到抗性。l l目前研究最多的是应用苏云金芽孢杆菌杀目前研究最多的是应用苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因来获得抗虫植物。虫晶体蛋
9、白基因来获得抗虫植物。l l苏云金芽孢杆菌 革兰氏阳性菌，于革兰氏阳性菌，于19021902年首次在日本发现年首次在日本发现 其在芽孢形成期，形成大量的伴孢晶体，其在芽孢形成期，形成大量的伴孢晶体，晶体是由原毒素亚单位（晶体是由原毒素亚单位（-内毒素内毒素）组成；）组成；大多数能同时产生几种晶体蛋白，每种蛋大多数能同时产生几种晶体蛋白，每种蛋白均具有高度特异的杀虫活性。白均具有高度特异的杀虫活性。l l中科院农业科学院生物技术研究中心已将中科院农业科学院生物技术研究中心已将苏云金芽孢杆菌毒性蛋白的基因，转移到苏云金芽孢杆菌毒性蛋白的基因，转移到水稻细胞的原生质体中，并培养出正常水水稻细胞的原生
10、质体中，并培养出正常水稻幼苗；稻幼苗；l l水稻组织中含有苏云金芽孢杆菌毒性蛋白水稻组织中含有苏云金芽孢杆菌毒性蛋白的基因，使水稻自身就可能产生抗虫害的的基因，使水稻自身就可能产生抗虫害的能力。能力。l l携带能杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌毒携带能杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因的转基因植物有烟草、棉花、性蛋白基因的转基因植物有烟草、棉花、番茄等；番茄等；l l此外，将抑制昆虫蛋白酶活性的基因引入此外，将抑制昆虫蛋白酶活性的基因引入到棉花和马铃薯中，可以使昆虫进食叶片到棉花和马铃薯中，可以使昆虫进食叶片后因肠消化功能被干扰而最终死亡。后因肠消化功能被干扰而最终死亡。l l转基因植物研究
11、中最突出的问题可能是昆转基因植物研究中最突出的问题可能是昆虫对植物产生的抗性。虫对植物产生的抗性。l l研究表明，与昆虫产生抗性有关的基因是研究表明，与昆虫产生抗性有关的基因是隐性基因，因此，在一个昆虫群体中有足隐性基因，因此，在一个昆虫群体中有足够多的敏感昆虫存在，那么昆虫抗性基因够多的敏感昆虫存在，那么昆虫抗性基因控制的性状出现的频率将会很小控制的性状出现的频率将会很小 。l l由于生物的共进化，如果抗性植物能在不由于生物的共进化，如果抗性植物能在不良环境下生长，那么引起病虫害的病毒和良环境下生长，那么引起病虫害的病毒和昆虫也会很快产生对不良生境的适应性；昆虫也会很快产生对不良生境的适应性
12、；l l如果抗性是由单基因控制的，那么只需如果抗性是由单基因控制的，那么只需2 21010年植物就会失去对病虫害的抗性；年植物就会失去对病虫害的抗性；l l所以今后不但要培育多基因抗性的品种，所以今后不但要培育多基因抗性的品种，而且被选用的多基因应该来自亲缘关系不而且被选用的多基因应该来自亲缘关系不甚密切的植物。甚密切的植物。l l转基因作物的大量种植有可能给环境生态转基因作物的大量种植有可能给环境生态带来意料不到的严重后果。带来意料不到的严重后果。l l目前国家对野生水稻已采取保护措施。目前国家对野生水稻已采取保护措施。l l采取时间隔离、空间隔离和遗传隔离等方采取时间隔离、空间隔离和遗传隔
13、离等方法，也许能控制植物基因逃逸并降低其对法，也许能控制植物基因逃逸并降低其对环境生态带来危害的几率。环境生态带来危害的几率。8.2 细胞工程与环境保护细胞工程与环境保护l1.细胞工程细胞工程 细胞工程是将细胞或原生质体在离体条细胞工程是将细胞或原生质体在离体条件下进行培养、繁殖和精细的人工操作，件下进行培养、繁殖和精细的人工操作，使其某些特性人为地发生改变，从而达到使其某些特性人为地发生改变，从而达到生产生物制品及其组分、改良生物品种或生产生物制品及其组分、改良生物品种或创造新物种的目的。创造新物种的目的。8.2.1 基本概念基本概念l l迄今为止，人们已经从基因水平、细胞器水平以及细胞水平
14、开展了多层次的大量工作，在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果，其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景。l l1838，哈泊兰德预言了植物细胞的全能性；，哈泊兰德预言了植物细胞的全能性；l l1907，美国哈里森培养了蛙胚神经组织；，美国哈里森培养了蛙胚神经组织；l l1934，荷兰温特发现生长素；，荷兰温特发现生长素；l l1960，英国诺丁汗大学科金教授使用酶解，英国诺丁汗大学科金教授使用酶解方法从番茄幼苗根部制备得到大量原生质方法从番茄幼苗根部制备得到大量原生质体；体；n n 细胞工程的发展历史细胞工程的发展历史l l1972，美
15、国卡尔森等用，美国卡尔森等用NaNO3为融合诱导为融合诱导剂，将来自不同种的烟草原生质体进行融剂，将来自不同种的烟草原生质体进行融合，获得世界上第一个体细胞杂种植株；合，获得世界上第一个体细胞杂种植株；l l1977，英国胚胎工程技术，首例试管婴儿；，英国胚胎工程技术，首例试管婴儿；l l1997，多莉克隆羊；，多莉克隆羊；l l2001，首例克隆猪，首例克隆猪 动植物细胞与组织培养；动植物细胞与组织培养；细胞融合；细胞融合；染色体工程；染色体工程；胚胎工程；胚胎工程；细胞遗传工程细胞遗传工程l l 主要研究内容主要研究内容l l优质植物快速培育与繁殖；优质植物快速培育与繁殖；l l动物胚胎工
16、程快速繁殖优良、濒危品种；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；l l利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；利用动植物细胞培养生产活性产物、药品；l l新型动植物品种的培育；新型动植物品种的培育；l l供医学器官修复或者移植的组织工程；供医学器官修复或者移植的组织工程；l l转基因动植物的生物工程反应器；转基因动植物的生物工程反应器；l l在遗传学、发育学等领域的理论研究；在遗传学、发育学等领域的理论研究；l l在能源、环保等领域的应用。在能源、环保等领域的应用。细胞工程重要应用 l2.原生质体融合原生质体融合 是指将两个亲株的细胞壁分别通过酶解去除，然后在高渗条件下使两原生质体融合，从而获得发
17、生了基因重组融合子的过程。l3.原生质体技术原生质体技术 包括原生质体制备、培养、融合、再生，原生质体转化等过程。优点是将两亲本的整个基因组强迫性混杂在一起，为异源DNA片段交叉互换创造一个优良的环境。l l4.原生质体制备 制备原生质体过程一般采用酶解法细菌等微生物没有坚固的细胞壁，而且细胞外周的化学成分因种属不同而差异甚远，但制备原生质体过程一般也采用酶解法。酵母菌原生质体制备一般取对数生长早期的细胞，菌悬液浓度为107个mol，在高渗缓冲溶液中用蜗牛酶处理去壁。此外，对酵母细胞进行酶解处理前，用某些含巯基化合物如-巯基乙醇进行预处理可以松动细胞壁结构蛋白，有利于酶解。对于原核生物中的革兰
18、氏阳性菌，制备原生质体时应针对不同的种属采用不同的溶菌酶浓度处理。小球菌属只需用1g/ml，枯草甘菌属则需要高达50g/ml，有时还需要加一定浓度的青霉素。丝状真菌丝状真菌一般采用含葡萄糖苷酶、几丁质酶、纤维毒素酶及果胶裂解酶复合物处理，以6mol/LMgSO4作为原生质体稳定剂；曲霉属曲霉属，有人推荐使用Bacil-lus circulan IAM1165酶和几丁质酶处理，用含有0.8mol/L山梨醇、0.6KCL及0.8Mininol做原生质体稳定剂，再生频率大于30l l5.促融因子促融因子 常用的有聚乙二醇（PEG）及Ca2+作为促融剂。细菌一般用3050（m/V）PEG，同时可加入C
19、a2+和DMSO进一步促进融合，时间仅需1min；真菌则采用2530高相对分子质量的PEG，pH9.0较好，同样Ca2+可提高融合效率。l l细胞融合技术在废水处理工程菌研究中的应用始于20世纪80年代。l l利用原生质体融合技术，可将多个细胞的优点集中于一个细胞内。8.2.2 细胞融合构建环境工程菌细胞融合构建环境工程菌l l程树培等将真核微生物酿酒酵母Y9407与原核微生物光合细菌球型红假单胞菌P9479的原生质体，经跨界融合构建出的融合细胞Foa和Fzl；l l通过链霉素和制霉菌素的抗性实验，细胞形态学观察，DNA含量分析和对捕光蛋白基因pucBA进行聚合酶链反应，证实该细胞为真正的融合细胞。l l融合细胞在耐酸耐热、絮凝性、降解效率、菌体得率多方面综合了双亲的优势，可望较好的应用于高浓度污水生物处理。l l8.3 酶与环境保护l l8.4 发酵工程与环境保护