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1、本章基本内容本章基本内容 一、概述 二、糖和苷的结构与分类 三、糖和苷的理化性质 四、糖和苷的提取与分离 五、糖和苷的检识 六、苷结构的研究 1第1页/共85页p 苷的提取与分离p 苷的检识p 苷的结构研究 第三讲第三讲2第2页/共85页掌握：苷的分类提取及其常用分离方法熟悉：苷的结构研究方法。了解：苷的检识方法3第3页/共85页1、提取：四、苷的提取分离4p 苷的种类不同，性质不同，提取分离方法也不同苷的种类不同，性质不同，提取分离方法也不同l苷：极性随着糖基的增多而增大。糖基增多，苷：极性随着糖基的增多而增大。糖基增多，苷元所占比例相应变小，亲水性增大。苷元所占比例相应变小，亲水性增大。l
2、苷元：一般可溶于低极性有机溶剂。苷元：一般可溶于低极性有机溶剂。第4页/共85页5 原生苷原生苷：先要设法先要设法抑制或破坏酶的活性抑制或破坏酶的活性,常用的方法是采用常用的方法是采用甲醇、乙醇或沸水甲醇、乙醇或沸水提取提取,或在药材中拌入或在药材中拌入CaCO3,在提取过程中要在提取过程中要尽量避免与酸或碱接触尽量避免与酸或碱接触，以防苷类被酸或碱水解次生苷：次生苷：可利用发酵、酶解、酸碱水解等方法处理药材，选择性部分水解以提可利用发酵、酶解、酸碱水解等方法处理药材，选择性部分水解以提高目标物产量。提取前将药材粗粉加适量水拌匀，加热至高目标物产量。提取前将药材粗粉加适量水拌匀，加热至35左右
3、保持左右保持2448小时，再用有机溶剂（醇、苯、氯仿、石油醚）进行提取小时，再用有机溶剂（醇、苯、氯仿、石油醚）进行提取第5页/共85页6 提取提取苷元苷元时，先用适当方法彻底水解苷类（酶解或酸水解），再用乙时，先用适当方法彻底水解苷类（酶解或酸水解），再用乙酸乙酯、氯仿、石油醚等极性小的有机溶剂提出苷元；也可先提取总苷，酸乙酯、氯仿、石油醚等极性小的有机溶剂提出苷元；也可先提取总苷，再水解成苷元再水解成苷元 例如：例如：大豆苷元（葛根）大豆苷元（葛根）第6页/共85页提取苷应注意问题1)破坏酶的活性:2)注意酸碱条件防止苷水解3)根据需要采取不同方法提取苷 苷元酸水解 原生苷防止水解 次生苷
4、酶解780以上加热以上加热60以上醇提取以上醇提取加入加入CaCO3后沸水煮后沸水煮第7页/共85页苷类的提取和分离流程苷类的提取和分离流程(系统溶剂提取法系统溶剂提取法 )8水沉水层先用水饱和第8页/共85页 经初步提取得到的苷类通常极性较大，且多为非结晶性物质，同时不同程度地混有其他物质，分离困难，一般需先除去杂质，再进一步分离纯化。n 除杂：可用溶剂沉淀法，也可用大孔树脂吸附法来富集、纯化总苷。2、分离9粗提物溶于少量粗提物溶于少量甲醇或水，加丙甲醇或水，加丙酮或乙醚使较纯酮或乙醚使较纯的苷类沉淀析出的苷类沉淀析出粗提物溶于水粗提物溶于水,上大孔上大孔树脂柱树脂柱,先用水洗去无先用水洗去
5、无机盐、糖、多肽等杂机盐、糖、多肽等杂质质,再用逐步增加浓度再用逐步增加浓度的稀醇洗脱苷类的稀醇洗脱苷类第9页/共85页n分离：综合应用各种色谱法硅胶：多用氯仿-甲醇系统洗脱。（常用，适用大多数苷）反相硅胶：水-甲醇或水-乙腈系统。（皂苷、某些亲水性苷）凝胶：Sephadex LH-20、Sephadex G系列。水-醇系统洗脱。（适于分子量不同的苷类，如蒽醌、二蒽酮类）大孔树脂、活性炭、纤维素、聚酰胺、离子交换树脂等大孔树脂法、溶剂法等通常可除掉其他杂质，获得总苷；柱色谱法可得到单体化合物10第10页/共85页物理吸附：分子间力，无选择性，可逆。硅胶、氧化铝、活性炭化学吸附：化学键，选择性较
6、强，常不可逆。硅胶生物碱 碱性氧化铝黄酮、蒽醌等半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆 聚酰胺根据物质吸附性差异进行分离根据物质吸附性差异进行分离11第11页/共85页物理吸附的基本规律：极性相似者易于吸附 n非极性吸附剂：活性炭非极性吸附剂：活性炭对非极性成分吸附强对非极性成分吸附强溶剂极性溶剂极性 吸附剂对溶质的吸附力吸附剂对溶质的吸附力 溶质可被极性弱的溶剂洗脱溶质可被极性弱的溶剂洗脱n极性吸附剂：硅胶、氧化铝极性吸附剂：硅胶、氧化铝 对极性物质亲和力强对极性物质亲和力强 溶剂极性溶剂极性 吸附剂对溶质的吸附力吸附剂对溶质的吸附力 溶质可被极性强的溶剂洗脱溶质可被极性强的溶剂洗脱 12第1
7、2页/共85页 一般物质：官能团的种类、数目、位置、碳链长短 R-COOHAr-OHR-OHR-NH-R-CO-NH-R-CHOR-CO-RR-COO-RR-O-RR-XR-H溶剂：介电常数，极性 环己烷（1.88）苯（2.29）无水乙醚（4.47）氯仿（5.20）乙酸乙酯（6.11）乙醇（26.0）甲醇（31.2）水（81.0）极性及强弱判断极性及强弱判断 13第13页/共85页活性炭吸附法G结晶、重结晶中脱色、脱臭A从大量稀水液中浓缩微量物质1 1）简单吸附法用于物质的浓缩与精制）简单吸附法用于物质的浓缩与精制14第14页/共85页硅胶吸附柱色谱n氧化铝吸附柱色谱氧化铝吸附柱色谱 A A吸
8、附剂：吸附剂：30306060倍，有时倍，有时100100200200倍倍 B B装柱：装柱：径高比（径高比（d/hd/h）1:151:151:201:20 干法装柱干法装柱/湿法装柱湿法装柱 C C上样：上样：干法上样干法上样/湿法上样湿法上样 D D洗脱：洗脱：等度等度/梯度（洗脱剂极性递增）梯度（洗脱剂极性递增）E E托尾：托尾：化学吸附：硅胶化学吸附：硅胶碱性成分碱性成分 洗脱剂中加入碱洗脱剂中加入碱 氧化铝氧化铝酸性成分酸性成分 洗脱剂中加入酸洗脱剂中加入酸 F F洗脱系统的选择：洗脱系统的选择：TLC Rf=0.2TLC Rf=0.20.30.32 2）吸附柱色谱法）吸附柱色谱法1
9、5第15页/共85页高分子聚合物不溶于常见有机溶剂对碱稳定对酸特别是无机酸稳定性差 可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸中性性 质质3 3）聚酰胺柱色谱）聚酰胺柱色谱 16第16页/共85页分子间氢键分子间氢键半化学吸附半化学吸附吸附原理吸附原理第17页/共85页u化合物在含水溶剂中大致有以下规律：形成氢键的基团数目：越多，越强。形成氢键的基团所处的位置：处于易形成分子内氢键者，减弱。分子中芳香化程度：高，增强。影影响响吸吸附附力力的的因因素素18第18页/共85页19第19页/共85页u各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力水 甲醇 乙醇 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液 影影响响吸吸附附力力
10、强强弱弱的的因因素素u化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强n水中最强水中最强常以水装柱、样品以水溶解上样常以水装柱、样品以水溶解上样n含水醇中次之含水醇中次之n醇中最弱醇中最弱常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱 EtOH-HEtOH-H2 2O O最常用最常用 弱弱强强20第20页/共85页醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。脱鞣处理生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离也有用途 应应 用用21第21页/共85页高分子聚合物白色球形颗粒多孔网状结构不溶于酸、碱、有机溶剂吸附原理：分子间力、氢键分子
11、筛 性质性质原理原理4 4）大孔吸附树脂）大孔吸附树脂 22第22页/共85页树脂的性质：非极性树脂 易吸附非极性化合物 极性树脂 易吸附极性化合物溶剂的性质：物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小影影响响吸吸附附力力强强弱弱的的因因素素23第23页/共85页n水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。n最常用：乙醇最常用：乙醇水水 n广泛应用于化合物的分离与富集工作中广泛应用于化合物的分离与富集工作中 如：如：苷类、糖类的分离苷类、糖类的分离 生物碱的精制生物碱的精制 多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。洗脱剂洗脱剂应应 用用2
12、4第24页/共85页根据物质分子大小差异进行分离根据物质分子大小差异进行分离透析法超滤法超速离心凝胶滤过法 gel filtration：凝胶渗透色谱 gel permeation chromtography 分子筛滤过 molecular sieve filtration25第25页/共85页凝胶三维网状结构的分子筛作用按分子量由大到小的顺序分离原原 理理凝胶滤过法凝胶滤过法 gel filtrationgel filtration：第26页/共85页葡聚糖凝胶Sephadex G：葡聚糖+交联剂（环氧氯丙烷）分子筛 水中应用 分离水溶性成份 商品型号按交联度分类，以10倍吸水量（ml/g）
13、表示羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20:Sephadex G-25羟丙基化所得 分子筛和反相色谱相结合 水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中使用 水溶性、脂溶性成分都可分 凝凝胶胶的的种种类类、性性质质及及应应用用27第27页/共85页根据物质离解程度不同分离进根据物质离解程度不同分离进行分离行分离离子交换法离子交换法 离子交换树脂为固定相，水，含水溶剂装柱含水流动相通过树脂可交换离子与树脂上的交换基团交换，吸附到树脂上 中性及无交换离子的成分流出将吸附到柱上的成分洗脱下来离子交换原理离子交换原理28第28页/共85页球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀离子交换树脂的性质离子交换树脂的
14、性质离子交换树脂的结构离子交换树脂的结构n母核n离子交换基团29第29页/共85页离子交换树脂的种类离子交换树脂的种类阳离子交换树脂：强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂：强碱性（-N+（CH3）3Cl-）弱碱性（-NH2，-NH-，-N=）30第30页/共85页离子交换树脂的应用离子交换树脂的应用不同电荷离子的分离 如水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离相同电荷但解离程度不同离子的分离 如碱性不同的生物碱的分离 31第31页/共85页水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离32第32页/共85页 碱性碱性 碱性不同的生物碱的分离碱性不
15、同的生物碱的分离33第33页/共85页苷的检识苷的检识:苷由糖和苷元组成，含有糖基是苷类的共性。因此，其共性检识的方法苷由糖和苷元组成，含有糖基是苷类的共性。因此，其共性检识的方法是检识分子中是否含有糖，这和糖类的检识类似。其苷元部分的检识将在相应的是检识分子中是否含有糖，这和糖类的检识类似。其苷元部分的检识将在相应的章节中介绍。章节中介绍。糖的检识糖的检识:主要是利用糖的还原性和糖的脱水反应所生成沉淀、产生的颜色变化等主要是利用糖的还原性和糖的脱水反应所生成沉淀、产生的颜色变化等现象来进行理化检识，色谱检识则利用薄层色谱和纸色谱等方法进行。现象来进行理化检识，色谱检识则利用薄层色谱和纸色谱等
16、方法进行。五、苷的检识34第34页/共85页p1、菲林反应和多伦反应：仅还原糖反应阳性，非还原糖和苷类反应阴性。p2、Molish反应p注意：单糖、低聚糖、多糖、苷类，Molish反应均为阳性丙酮、甲酸、乳酸、草酸、没食子酸、苯三酚、-萘酚和葡萄糖醛酸以及各种醛糖衍生物Molish反应也为阳性排除检识反应过程中水解产生的游离糖的干扰排除游离糖的干扰（正丁醇萃取苷类）氨基糖反应阴性，碳苷和糖醛酸苷有时呈阴性（一）理化检识35第35页/共85页36p方法方法取样品的提取液取样品的提取液1 1mlml，加加5%5%-萘酚乙醇液萘酚乙醇液1 13 3滴，摇匀滴，摇匀后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，若在两液面
17、间有紫色环产后沿试管壁缓缓加入浓硫酸，若在两液面间有紫色环产生，说明样品组成中含有糖或苷类。生，说明样品组成中含有糖或苷类。样品提取液紫色环浓硫酸浓硫酸-萘酚萘酚乙醇乙醇第36页/共85页水提取液水提取液水液水液正丁醇液正丁醇液供试品供试品呈阳性呈阳性萃萃 取取正丁醇正丁醇蒸干蒸干Molish反反应应苷类单糖、低聚糖、多糖苷类37n水提取液往往含有大量的单糖、低聚糖、多糖等，水提取液往往含有大量的单糖、低聚糖、多糖等，难以直接检识苷类，可用正丁醇萃取，正丁醇萃难以直接检识苷类，可用正丁醇萃取，正丁醇萃取液蒸去溶剂后进行取液蒸去溶剂后进行Molish反应，如呈阳性则表反应，如呈阳性则表明含有苷类
18、。明含有苷类。第37页/共85页38样品样品滤液滤液菲林反应菲林反应多糖多糖反应液反应液呈阳性呈阳性Molish反反应应过过 滤滤苷类苷类乙醇乙醇溶解溶解不溶物不溶物氧化亚铜沉淀氧化亚铜沉淀游离糖游离糖因浓硫酸可将结合糖水解为游离糖，因浓硫酸可将结合糖水解为游离糖，MolishMolish反应阳性仅能说反应阳性仅能说明样品中含有游离或结合的糖，却不能判定是苷类还是游离明样品中含有游离或结合的糖，却不能判定是苷类还是游离糖或其他形式的糖糖或其他形式的糖第38页/共85页 样品酸水解后放冷的反应液出现沉淀，样品酸水解后放冷的反应液出现沉淀，则存在苷类化合物。因为苷类在酸水中水则存在苷类化合物。因为
19、苷类在酸水中水解产生糖和苷元，苷元一般具有亲脂性，解产生糖和苷元，苷元一般具有亲脂性，水溶性差，易在水解液中析出沉淀。水溶性差，易在水解液中析出沉淀。多糖和低聚糖水解后产生单糖水溶性好，多糖和低聚糖水解后产生单糖水溶性好，不会产生沉淀。不会产生沉淀。39p 3 3、水解反应：、水解反应：第39页/共85页1、薄层色谱、薄层色谱1)硅胶板硅胶板2)展开剂：正丁醇展开剂：正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水（水（4：1：5上层），上层），乙酸乙酯乙酸乙酯-正丁醇正丁醇-水（水（4：5：1上层），上层），氯仿氯仿-甲甲醇醇-水（水（65：35：10下层）等含水系统下层）等含水系统3)显色剂：硫酸、茴香醛硫酸、苯
20、胺显色剂：硫酸、茴香醛硫酸、苯胺-邻苯二甲邻苯二甲酸等酸等4)硅胶用硅胶用0.03mol/L硼酸溶液或无机盐水溶液代硼酸溶液或无机盐水溶液代替水涂布薄层，能增加糖在固定相中的溶解度，替水涂布薄层，能增加糖在固定相中的溶解度，样品承载量明显增加。样品承载量明显增加。（二）色谱检识40第40页/共85页2、纸色谱展开剂：展开剂：正丁醇正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水水(4(4：1 1：5 5上层，上层，BAW)BAW)，正丁醇，正丁醇-乙醇乙醇-水水(4(4：2 2：1)1)，水饱和的水饱和的苯酚。苯酚。显色剂：显色剂：苯胺苯胺-邻苯二甲酸、间苯二酚邻苯二甲酸、间苯二酚-盐酸等。盐酸等。41问题：纸色谱中
21、以问题：纸色谱中以BAWBAW和正丁醇作展开剂，展开糖，谁的和正丁醇作展开剂，展开糖，谁的RfRf值大？值大？第41页/共85页（一）物理常数测定：如熔点、比旋度、溶解度等。（一）物理常数测定：如熔点、比旋度、溶解度等。（二）分子量和分子式的测定（二）分子量和分子式的测定p 经典方法：元素分析，分子量测定。经典方法：元素分析，分子量测定。p 现代方法：现代方法：质谱法质谱法（MS，mass spectrum）六、苷的结构研究42确定分子量、分子式确定分子量、分子式提供部分结构信息提供部分结构信息 丢失碎片的大小丢失碎片的大小 如如1515、1717 碎片的碎片的m/zm/z及裂解方式及裂解方式
22、第42页/共85页（三）组成苷的苷元和糖的鉴定（三）组成苷的苷元和糖的鉴定苷用稀酸或酶进行水解苷用稀酸或酶进行水解单糖和苷元，再鉴定。单糖和苷元，再鉴定。1 1、苷元的结构鉴定、苷元的结构鉴定根据化学性质判断类型和母核结构。（根据化学性质判断类型和母核结构。（IRIR、UVUV）2 2、苷中组成糖的种类鉴定、苷中组成糖的种类鉴定常采用常采用PCPC、TLCTLC、GCGC对糖进行鉴定，也可通过对糖进行鉴定，也可通过NMRNMR进行鉴定。进行鉴定。3 3、苷中糖的数目的、苷中糖的数目的测定测定43第43页/共85页（五）糖和糖之间连接顺序的（五）糖和糖之间连接顺序的确定确定44（六）苷键构型的确
23、定（六）苷键构型的确定（或或构构型）型）1、利用酶水解进行测定、利用酶水解进行测定2、利用、利用NMR确定苷键构型确定苷键构型3、利用、利用klyne 经验公式进行测定经验公式进行测定 1、部分水解法、部分水解法2、利用、利用NMR确定确定（四）苷分子中苷元和糖，糖和糖之间连接位置的（四）苷分子中苷元和糖，糖和糖之间连接位置的确定确定1、苷元与糖分子之间连接位置的确定：、苷元与糖分子之间连接位置的确定：13CNMR法（苷化位移）法（苷化位移）2、糖与糖之间连接位置的确定：、糖与糖之间连接位置的确定：乙酰解、甲醇解法、乙酰解、甲醇解法、NMR法法第44页/共85页p常用质谱技术及特点电子轰击质谱
24、（EI-MS，electron impact ionization）场解析质谱（FD-MS，field desorption ionization）快速原子轰击质谱（FAB-MS，fast atom bombardment）电喷雾质谱（ESI-MS，electrospray ionization）化学电离质谱（CI-MS）高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MS）45第45页/共85页样品需加热气化，离化，得到M+难气化、易热解的成份测不到M+如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素电子轰击质谱（电子轰击质谱（EI-MSEI-MS）场解析质谱（场解析质谱（FD-MSFD-MS）试样稀液涂于钨丝
25、上作阳极，对面加阴极，通高压，使电离试样稀液涂于钨丝上作阳极，对面加阴极，通高压，使电离难气化、易热解的成份，可得到难气化、易热解的成份，可得到 分子离子相关峰：分子离子相关峰：MMH+H+、MMNa+Na+、MMK+K+逐个脱去糖基的碎片峰：逐个脱去糖基的碎片峰：MMH-162+H-162+、MMH-162-146+H-162-146+苷元的碎片离子相对少苷元的碎片离子相对少46第46页/共85页p离子枪发射高能离子与另一中性粒子碰撞，交换电荷，形成高速中性粒子，与样品碰撞，使其电离p难气化、易热解的成份，可得到 分子离子相关峰：MH+、MNa+、MK+逐个脱去糖基的碎片峰：MH-162+、
26、MH-162-146+p可得到苷元的碎片快速原子轰击质谱（快速原子轰击质谱（FAB-MSFAB-MS）p分子量及分子量及M-1、M-H2O等等 裂解碎片的精确质量裂解碎片的精确质量高分辨快原子轰击质谱（高分辨快原子轰击质谱（HR-FAB-MSHR-FAB-MS）47第47页/共85页3 3、苷中糖的数目的测定、苷中糖的数目的测定p 经典：利用经典：利用PCPC或或TLCTLC法鉴定种类，再用光密度扫描测定单法鉴定种类，再用光密度扫描测定单糖斑点含量，算出各糖的分子比，推测成苷的糖的数目。糖斑点含量，算出各糖的分子比，推测成苷的糖的数目。p 现代：利用质谱（现代：利用质谱（MSMS）测定苷和苷元
27、的分子量）测定苷和苷元的分子量计算差计算差值值求出糖数目。求出糖数目。p 根据根据1H-NMR1H-NMR谱中端基碳质子信号（谱中端基碳质子信号（4.36.0ppm4.36.0ppm）推算）推算糖数目。糖数目。p 利用利用13C-NMR13C-NMR谱糖的端基碳信号（谱糖的端基碳信号（90112ppm90112ppm）或根据）或根据苷的总苷的总C C信号与苷元信号与苷元C C信号数目推算。信号数目推算。p 1H1H COSY 1H1H COSY，1H13C COSY1H13C COSY等二维谱推算糖数目。等二维谱推算糖数目。48第48页/共85页原理：1H、13C等具有磁矩的原子在外加磁场中受
28、电磁波照射，吸收一定能量电磁波，产生能级变化，引起核磁共振氢核磁共振（1H-NMR）碳核磁共振谱（13C-NMR）二维核磁共振谱（2D-NMR）核磁共振核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）49第49页/共85页氢核磁共振（氢核磁共振（1 1H-NMRH-NMR）n 应用：应用：提供提供H的类型、数目、相邻原子团的信息的类型、数目、相邻原子团的信息n 四个参数：四个参数：o化学位移（化学位移（）：11020ppm H的类型的类型 屏蔽效应屏蔽效应o积分值积分值/积分面积积分面积 同一环境下同一环境下H的个数的个数o自旋偶合裂分的峰数自旋偶合裂分的峰数 邻位与其
29、不等同的邻位与其不等同的H的个数的个数 符合符合 n+1律律 s,d,t,qo偶合常数（偶合常数（J）H核间的距离核间的距离 相隔键数：相隔键数：越少，越少，J大，通常为大，通常为3JH-H 二面角：越接近二面角：越接近90，J越小；越接近越小；越接近0、180，J越大越大 远程偶合远程偶合(4 4J JH-HH-H)：第50页/共85页p邻位偶合常数：与两面角有关两面角90度 J=0Hz；两面角0或180度 J=68Hz；两面角60度 J=24Hz对于糖质子 当2-H为直立键时，1位苷键的取向不同，1-H与2-H的两面角不同，偶合常数亦不同：1-H和2-H键为双直立键，=180，J=68Hz
30、 1-H为平伏键，2-H直立键，=60，J=24Hz 51第51页/共85页 当2-H为平伏键的情况下，1-H无论处于平伏键还是直立键，与2-H的两面夹角均约60度，故不能用该法判断苷键构型。六碳醛糖中六碳醛糖中C2构型与葡萄糖不一致的构型与葡萄糖不一致的D-甘露糖的苷键，甘露糖的苷键，就不能用端基质子的偶合常数来判断其构型。就不能用端基质子的偶合常数来判断其构型。-D-D-甘露糖苷甘露糖苷 -D-D-甘露糖苷甘露糖苷52第52页/共85页 Jac=1.6Jac=1.62.0Hz2.0HzJbc=0Jbc=01.5Hz1.5Hz烯丙偶合烯丙偶合芳环上的偶合芳环上的偶合Jab=6Jab=610
31、Hz10 HzJac=1Jac=13Hz3HzJad=0Jad=01 Hz1 Hz第53页/共85页碳核磁共振谱（碳核磁共振谱（1313C-NMRC-NMR）最重要的参数：化学位移：1200ppm C的类型 13C的信号裂分 13C-NMR：异核偶合1H-NMR：同核偶合偶合裂分峰数：C的级别 符合n+1律，s,d,t,q，有1JC-H 2JC-H 3JC-H54第54页/共85页糖的糖的1H-NMR特征特征 化学位移规律：甲基质子：1.0ppm 特点：比较容易辨认 用途：1、确定甲基五碳糖的个数2、确定糖的种类3、确定糖与糖、糖与苷元的连接位置55第55页/共85页 p端基质子：端基质子：4
32、.36.0ppm；其余部位的质其余部位的质子信号均在子信号均在3.2-4.2左右左右 特点：比较容易辨认特点：比较容易辨认 用途：用途：1、确定糖基的个数、确定糖基的个数 2、确定糖基的种类、确定糖基的种类 3、2D-NMR谱上糖信号的归属谱上糖信号的归属56第56页/共85页 其余质子信号：3.24.2ppm 特点:信号集中,难以解析 归属:往往需借助2D-NMR技术。57第57页/共85页58端基质子：端基质子：4.36.0ppm；其余其余部位的质子信号均在部位的质子信号均在3.2-4.2第58页/共85页59甲基质子：1.0ppm端基质子：端基质子：4.36.0ppm；其余部位其余部位3
33、.2-4.2第59页/共85页 糖上碳信号可分为几类，大致范围为：p CH3：18ppm 甲基五碳糖的C6，一般有几个信号(扣除苷元中的甲基)可表示有几个甲基五碳糖存在。p CH2OH：62ppm C5或C6p CHOH：7085ppm 糖氧环上的C2C4p-O-CH-O-：95105ppm 端基C，在此范围内有几个信号可视为有几种糖存在于糖链的重复单位中。p 糖上-OCH3:65ppm糖的糖的13C NMR特征特征60第60页/共85页糖糖C-1C-2C-3C-4C-5C-6-D-葡萄糖葡萄糖96.775.176.770.676.861.7-D-葡萄糖葡萄糖92.972.573.870.67
34、2.361.6-D-半乳糖半乳糖97.372.973.869.776.062.2-D-半乳糖半乳糖93.269.470.270.371.462.0部分单糖分子的碳谱数据部分单糖分子的碳谱数据第61页/共85页p 经典方法：化学降解或酶解经典方法：化学降解或酶解产物产物p现代方法：现代方法：NMR法法 2D-NMR谱中，谱中，HMBC（氢（氢-碳远程相关）谱已成为确定苷碳远程相关）谱已成为确定苷元连接位置的主要方法。可以观察到糖的端基质子与苷元元连接位置的主要方法。可以观察到糖的端基质子与苷元-碳原子信号以及苷元碳原子信号以及苷元-碳原子上的质子与糖的端基碳信号的碳原子上的质子与糖的端基碳信号的
35、相关峰。相关峰。13C-NMR谱是确定苷元与糖连接位置的有效方法谱是确定苷元与糖连接位置的有效方法(利用苷化位移规律，将苷与苷元的碳谱相比较即可鉴别)（四）苷元和糖，糖和糖之间连接位置的确定（四）苷元和糖，糖和糖之间连接位置的确定1、苷元与糖分子之间连接位置的确定、苷元与糖分子之间连接位置的确定第62页/共85页苷化位移p 概念：糖与苷元成苷后，苷元的-C、-C和糖的端基碳的化学位移值均发生了改变，这种改变称苷化位移。p 作用：推测糖与苷元、糖与糖的连接位置以及碳氢信号的归属。第63页/共85页 醇羟基苷化引起醇羟基苷化引起-碳原子向低场位移（碳原子向低场位移（4-10ppm），），-碳原子向
36、高场位移（碳原子向高场位移（0.9-4.6ppm）；）；如：伯醇如：伯醇 第64页/共85页 酚羟基、羧基苷化引起酚羟基、羧基苷化引起-碳原子均向高场位移，碳原子均向高场位移，-碳碳原子向低场位移，此外对位碳原子也向低场移动。原子向低场位移，此外对位碳原子也向低场移动。（酚（酚羟基苷化引起端基碳向低场位移、羧基使端基碳向高场羟基苷化引起端基碳向低场位移、羧基使端基碳向高场位移）。如三萜类化合物位移）。如三萜类化合物齐墩果酸：齐墩果酸：65第65页/共85页p（1 1）化学方法化学方法:将全甲基化苷进行甲醇解，鉴定（与对照品共色谱），未将全甲基化苷进行甲醇解，鉴定（与对照品共色谱），未全甲醚化的
37、单糖，游离羟基所在位置即糖与糖之间的连接位置。全甲醚化的单糖，游离羟基所在位置即糖与糖之间的连接位置。2、糖与糖之间连接位置的确定、糖与糖之间连接位置的确定66第66页/共85页p以缓和酸水解和酶水解法最为常用。缓和酸水解多使用低浓度的无机强酸或中强度的有机酸(如草酸)进行水解，可使苷中的部分糖水解脱去。例如：1 1）部分水解法）部分水解法结果分析：由于在水解产物中检出木糖，因此可结果分析：由于在水解产物中检出木糖，因此可以确定木糖连接在末端。以确定木糖连接在末端。第67页/共85页p开裂一部分苷键，保留另一部分苷键，分析水解产物中得到的乙酰化低聚糖，也可以确定糖的连接顺序。682 2）乙酰解
38、法）乙酰解法第68页/共85页用乙酐-ZnCI2乙酰解后，TLC检出了单糖、四糖和三糖的乙酰化物，并与标准品对照进行鉴定，由此可推出苷分子中糖的连接方式。69第69页/共85页甲基化的单糖，根据单糖的甲基化位置判断糖的连接位置。甲基化的单糖，根据单糖的甲基化位置判断糖的连接位置。全甲基化全甲基化甲醇解甲醇解糖的端基半缩糖的端基半缩醛羟基甲基化醛羟基甲基化3 3）先甲基化，再甲醇解）先甲基化，再甲醇解第70页/共85页将糖链全甲基化，然后水解苷键，用GC鉴定所获得的甲基化单糖，其中游离-OH的部位就是连结位置,全甲基化的单糖即为末端糖。此外，目前常使用 13C-NMR 方法，主要是通过归属各碳信
39、号，以确定产生苷化位移的碳。第71页/共85页p苷化位移苷化位移-要判断苷中两个糖的连接位置，要判断苷中两个糖的连接位置，可将该糖的碳谱数据与单糖比较，可将该糖的碳谱数据与单糖比较，若内端糖若内端糖的某碳原子向低场位移（的某碳原子向低场位移（4-7ppm)4-7ppm)，而其邻，而其邻碳又向高场位移（碳又向高场位移（1-4ppm1-4ppm），那么该碳原子），那么该碳原子为连接糖的位置。为连接糖的位置。p2D-NMR2D-NMR谱中，谱中，HMBCHMBC（氢（氢-碳远程相关）已碳远程相关）已成为确定苷元的连接位置的主要方法。成为确定苷元的连接位置的主要方法。72（2 2）波谱解析）波谱解析N
40、MRNMR法法第72页/共85页p EI-MS谱：全乙酰化、甲基化或三甲基硅醚化谱：全乙酰化、甲基化或三甲基硅醚化衍生化的糖基离子峰。衍生化的糖基离子峰。pFD-MS谱或谱或FAB-MS谱：各种不同解离程度的糖谱：各种不同解离程度的糖基碎片离子峰。如人参皂苷基碎片离子峰。如人参皂苷Rb2的的FD-MS谱中谱中(M+Na)+-132表明末端有表明末端有阿拉伯阿拉伯糖。糖。(M+Na)+-162表明末端有葡萄糖。表明末端有葡萄糖。(M+Na)+-294表明葡萄表明葡萄糖糖-阿拉伯糖链。阿拉伯糖链。（3 3）MSMS法法第73页/共85页（五）糖和糖之间连接顺序的确定（五）糖和糖之间连接顺序的确定p
41、 经典方法：化学降解或酶解经典方法：化学降解或酶解产物产物p 现代方法：现代方法：NMRNMR法法 糖与糖相连，内侧糖连接糖的碳原子移向低场（糖与糖相连，内侧糖连接糖的碳原子移向低场（447 7 ppmppm），相邻碳原子移向高场（），相邻碳原子移向高场（-1-1-4 ppm-4 ppm）74苷苷 缓和酸水解、酶解缓和酸水解、酶解 乙酰解乙酰解 全甲基化甲醇解全甲基化甲醇解 部分苷键断裂部分苷键断裂的裂解产物的裂解产物 推推 断断 分分 析析 第74页/共85页p 一般不同的水解酶可水解不同类型的苷键，如麦一般不同的水解酶可水解不同类型的苷键，如麦芽糖酶能水解芽糖酶能水解-苷键，苦杏仁酶可水解
42、苷键，苦杏仁酶可水解-苷键。苷键。（六）苷键构型的确定（六）苷键构型的确定（或或构型）构型）1、利用酶水解进行测定、利用酶水解进行测定第75页/共85页2、利用、利用NMR确定苷键构型确定苷键构型H-2H-2为为a a键的糖键的糖葡萄糖、木糖、半乳糖等葡萄糖、木糖、半乳糖等H-1H-1为为a a键时：键时：H-1H-1和和H-2H-2为为aaaa偶合，偶合，Jaa=6Jaa=69Hz9HzH-1H-1为为e e键时：键时：H-1H-1和和H-2H-2为为aeae偶合，偶合，Jae=2Jae=23Hz3Hz1H-NMR法是目前常用的比较准确的方法。法是目前常用的比较准确的方法。第76页/共85页
43、77-D-葡萄糖苷葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷鼠李糖苷 J12=Jae=23 Hz J12=Jae=2 Hz -D-葡萄糖苷葡萄糖苷 -L-鼠李糖苷鼠李糖苷 J12=Jaa=69 Hz J12=Jae=2 Hz 77第77页/共85页H-2H-2为为为为e e键的糖键的糖键的糖键的糖鼠李糖、甘露糖等鼠李糖、甘露糖等鼠李糖、甘露糖等鼠李糖、甘露糖等H-1为为e键时：键时：H-1和和H-2为为ee偶合，偶合，Jee=23HzH-1为为a键时：键时：H-1和和H-2为为ea偶合，偶合，Jea=23Hz第78页/共85页(1)利用端基碳原子的化学位移判断苷键构型：除利用端基碳原子的化学位移判断苷键构型：除
44、D-甘露糖、甘露糖、L-鼠李糖外，绝大多数单糖甲苷，其鼠李糖外，绝大多数单糖甲苷，其-型与型与-型的化学位型的化学位移相差移相差4ppm。（。（P71）(2)利用端基碳原子与端基质子的偶合常数判断苷键构型：利用端基碳原子与端基质子的偶合常数判断苷键构型：-甲苷甲苷 JC1-H1170Hz-甲苷甲苷JC1-H1160Hz 10ppm13C-NMR法法构型构型D-葡萄糖甲苷葡萄糖甲苷D-甘露糖甲苷甘露糖甲苷L-鼠李糖甲苷鼠李糖甲苷170Hz166Hz168Hz159Hz156Hz158Hz几种甲苷的几种甲苷的JC1-H1值值79第79页/共85页803、利用、利用klyne 经验公式进行测定经验公
45、式进行测定 Klyne经验公式经验公式 M苷苷 DM苷元苷元 D M糖糖 D M苷苷 DM苷元苷元 D MD 与已知糖甲苷比与已知糖甲苷比 MD、MD 与哪一种接近就可确定其为哪种构型与哪一种接近就可确定其为哪种构型 注注意意：此此法法只只适适合合单单糖糖苷苷，或或两两个个苷苷的的结结构构在在糖的连接末端仅差一个单糖的分子。糖的连接末端仅差一个单糖的分子。第80页/共85页波谱分析在糖苷结构测定中的应用总波谱分析在糖苷结构测定中的应用总结结MS1H-NMR 13C-NMR糖种类 糖各质子的、J（与标准糖对照）碳信号 （与标准糖对照）糖数目 分子量之差（苷-苷元）端基质子信号数（位于低场）端基碳
46、信号数（90112ppm）衍生物信号数（甲氧基特征）（乙酰氧基特征）碳信号之差（苷-苷元信号差）苷元与糖 连接位置 苷化位移规律（苷与苷元碳谱相比较糖与糖连接位置 苷化位移规律（苷与各糖碳谱相比较）糖糖与连接顺序 各糖碎片离子峰（与特征性末端糖 双糖数据相比较）自旋-弛豫时间（末端糖的NT1最大）苷键构型 端基质子J1-2 -型23Hz -型69Hz （H-2为键）端基碳(、相差4ppm)端基碳JC-H -甲苷 170Hz -甲苷 160Hz（10ppm）第81页/共85页小 结p糖的结构p糖与苷的分类p糖与苷的检识p苷提取p苷的结构研究82第82页/共85页1、如何判断某中草药中是否含有糖和苷类成分？2、什么是两相水解法？为什么通过它可以得到真正的苷元？3、如何用NMR来判断苷键的构型？83 作业作业第83页/共85页谢谢！谢谢！第84页/共85页感谢您的观看！第85页/共85页